赵亮　徐炳欣　石晓晓　兰丙欣

【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质的方法。方法 应用HPLC法， 色谱柱为Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长为227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。结果 紫杉醇浓度在10～125 mg·L-1的范围内， 溶液的浓度与色谱峰面积线性关系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度试验RSD为0.17%（n=5）， 平均加样回收率为99.33%， RSD=0.38%。结论 本方法简便、准确、快速、重复性好， 可用于紫杉醇注射液的含量测定和有关物质检查。

【关键词】 紫杉醇注射液；高效液相色谱法；含量测定；有关物质

紫杉醇（paclitaxel）是从短叶紫杉树皮中提取的具有抗癌活性物质， 为一种新型的抗微管药物[1]。紫杉醇的作用机制为：促进微管双聚体装配成微管， 并通过干扰去多聚化过程而使微管的稳定， 从而抑制微管网正常动力学重组， 导致细胞分裂受阻。此外， 本药还具有放射增敏效应， 可促进离子照射所致细胞损害[2， 3]。临床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症的治疗[4， 5]。药物含量是评价药品质量的重要指标之一， 为保证紫杉醇注射液的质量， 实现临床用药安全可靠， 作者尝试建立高效液相色谱法（HPLC）测定其含量。该方法准确， 重复性好， 专属性强， 与中国药典2010年版收录的紫杉醇含量测定方法相比较， 具有简便、快速的优点。

1 仪器与试药

岛津LC-15C高效液相色谱仪；岛津SPD-15C Essentia uv/vis检测器；岛津工作站LC-solution；AR 1140 型电子天平（梅特勒·托利多仪器有限公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AUW 120D 型电子天平（日本岛津公司）。

紫杉醇对照品（许昌恒生药业有限公司提供， 纯度>99.9%， 批号为A0177）；紫杉醇注射液（购于江苏红豆衫药业有限公司， 规格5 ml/30 mg， 批号分别为20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；乙腈（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；其它试剂均为分析纯， 水为超纯水。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 对照品溶液的配制 精密称取紫杉醇对照品适量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得浓度为500 mg·L-1对照品贮备液。

2. 3 样品溶液的制备 分别取批号为20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液适量， （相当于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀即得。

2. 4 专属性试验 紫杉醇对照品（A）和样品中紫杉醇的HPLC图（B）， 见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）

2. 5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分别置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得到对照品浓度分别为10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；进样， 记录峰面积值。以对照品浓度（X）为横坐标， 对照品峰面积（Y）为纵坐标， 进行线性回归， 得回归方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1时线性关系良好。

2. 6 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液， 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次， 其峰面积的RSD为0.17%（n=5）。

2. 7 稳定性试验 取“2.3”项下样品溶液（批号：20130805）在室温避光下放置， 分别于0、2、4、6、8、12 h时， 在仪器不关闭状态下测定不同时间内的含量。结果， 样品含量的RSD为0.26%（n=6）， 表明样品溶液在12 h内稳定性好。

2. 8 加样回收率试验 精密量取已知含量批号为20130805的紫杉醇注射液适量（相当于紫杉醇3 mg）， 分别精密加入紫杉醇对照品适量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表1。

2. 9 样品含量测定 将3批样品溶液分别按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表2。

2. 10 有关物质检查 采用不加校正因子的主成分自身对照法。精密称取紫杉醇适量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 制成200 mg·L-1的溶液作为供试品溶液；取供试品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流动相稀释至刻度， 作为对照溶液。取对照溶液20 μl进样， 调节检测灵敏度， 使主峰高达到记录仪满量程的10%左右， 再取供试品溶液进样20 μl， 记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。扣除溶剂峰和辅料峰， 量取色谱图上紫杉醇色谱峰外各杂质的峰面积总和， 并与对照溶液主成分的峰面积比较， 计算杂质含量。结果见表2， 3批样品中有关物质均<1.2%。

3 讨论

应用紫外分光光度计对紫杉醇在190～400 nm范围内扫描， 结果显示紫杉醇在227 nm处有较强吸收。作者采用227 nm作为该分析方法的检测波长， 可获得较高灵敏度， 基线平稳， 良好的峰形。

为了得到一个良好的分析效果， 作者在试验中对流动相进行了优化。试验分别考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-乙腈-水系统， 结果发现以甲醇-乙腈-水系统为流动相， 在选定的检测波长条件下， 基线稳定， 能够得到良好的峰形， 最终确定流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）为该分析方法的流动相。总之， 本方法操作简便、准确度高、重现性好， 可用于紫杉醇含量的测定与质量控制。

参考文献

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 赵惠.紫杉醇周围神经毒性临床观察.中国实用医药， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龚奎玉，王志东，李建璜.中国实用医药， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.

【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质的方法。方法 应用HPLC法， 色谱柱为Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长为227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。结果 紫杉醇浓度在10～125 mg·L-1的范围内， 溶液的浓度与色谱峰面积线性关系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度试验RSD为0.17%（n=5）， 平均加样回收率为99.33%， RSD=0.38%。结论 本方法简便、准确、快速、重复性好， 可用于紫杉醇注射液的含量测定和有关物质检查。

【关键词】 紫杉醇注射液；高效液相色谱法；含量测定；有关物质

紫杉醇（paclitaxel）是从短叶紫杉树皮中提取的具有抗癌活性物质， 为一种新型的抗微管药物[1]。紫杉醇的作用机制为：促进微管双聚体装配成微管， 并通过干扰去多聚化过程而使微管的稳定， 从而抑制微管网正常动力学重组， 导致细胞分裂受阻。此外， 本药还具有放射增敏效应， 可促进离子照射所致细胞损害[2， 3]。临床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症的治疗[4， 5]。药物含量是评价药品质量的重要指标之一， 为保证紫杉醇注射液的质量， 实现临床用药安全可靠， 作者尝试建立高效液相色谱法（HPLC）测定其含量。该方法准确， 重复性好， 专属性强， 与中国药典2010年版收录的紫杉醇含量测定方法相比较， 具有简便、快速的优点。

1 仪器与试药

岛津LC-15C高效液相色谱仪；岛津SPD-15C Essentia uv/vis检测器；岛津工作站LC-solution；AR 1140 型电子天平（梅特勒·托利多仪器有限公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AUW 120D 型电子天平（日本岛津公司）。

紫杉醇对照品（许昌恒生药业有限公司提供， 纯度>99.9%， 批号为A0177）；紫杉醇注射液（购于江苏红豆衫药业有限公司， 规格5 ml/30 mg， 批号分别为20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；乙腈（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；其它试剂均为分析纯， 水为超纯水。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 对照品溶液的配制 精密称取紫杉醇对照品适量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得浓度为500 mg·L-1对照品贮备液。

2. 3 样品溶液的制备 分别取批号为20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液适量， （相当于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀即得。

2. 4 专属性试验 紫杉醇对照品（A）和样品中紫杉醇的HPLC图（B）， 见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）

2. 5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分别置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得到对照品浓度分别为10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；进样， 记录峰面积值。以对照品浓度（X）为横坐标， 对照品峰面积（Y）为纵坐标， 进行线性回归， 得回归方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1时线性关系良好。

2. 6 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液， 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次， 其峰面积的RSD为0.17%（n=5）。

2. 7 稳定性试验 取“2.3”项下样品溶液（批号：20130805）在室温避光下放置， 分别于0、2、4、6、8、12 h时， 在仪器不关闭状态下测定不同时间内的含量。结果， 样品含量的RSD为0.26%（n=6）， 表明样品溶液在12 h内稳定性好。

2. 8 加样回收率试验 精密量取已知含量批号为20130805的紫杉醇注射液适量（相当于紫杉醇3 mg）， 分别精密加入紫杉醇对照品适量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表1。

2. 9 样品含量测定 将3批样品溶液分别按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表2。

2. 10 有关物质检查 采用不加校正因子的主成分自身对照法。精密称取紫杉醇适量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 制成200 mg·L-1的溶液作为供试品溶液；取供试品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流动相稀释至刻度， 作为对照溶液。取对照溶液20 μl进样， 调节检测灵敏度， 使主峰高达到记录仪满量程的10%左右， 再取供试品溶液进样20 μl， 记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。扣除溶剂峰和辅料峰， 量取色谱图上紫杉醇色谱峰外各杂质的峰面积总和， 并与对照溶液主成分的峰面积比较， 计算杂质含量。结果见表2， 3批样品中有关物质均<1.2%。

3 讨论

应用紫外分光光度计对紫杉醇在190～400 nm范围内扫描， 结果显示紫杉醇在227 nm处有较强吸收。作者采用227 nm作为该分析方法的检测波长， 可获得较高灵敏度， 基线平稳， 良好的峰形。

为了得到一个良好的分析效果， 作者在试验中对流动相进行了优化。试验分别考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-乙腈-水系统， 结果发现以甲醇-乙腈-水系统为流动相， 在选定的检测波长条件下， 基线稳定， 能够得到良好的峰形， 最终确定流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）为该分析方法的流动相。总之， 本方法操作简便、准确度高、重现性好， 可用于紫杉醇含量的测定与质量控制。

参考文献

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 赵惠.紫杉醇周围神经毒性临床观察.中国实用医药， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龚奎玉，王志东，李建璜.中国实用医药， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.

【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质的方法。方法 应用HPLC法， 色谱柱为Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长为227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。结果 紫杉醇浓度在10～125 mg·L-1的范围内， 溶液的浓度与色谱峰面积线性关系良好（R2=0.9998， n=6）。精密度试验RSD为0.17%（n=5）， 平均加样回收率为99.33%， RSD=0.38%。结论 本方法简便、准确、快速、重复性好， 可用于紫杉醇注射液的含量测定和有关物质检查。

【关键词】 紫杉醇注射液；高效液相色谱法；含量测定；有关物质

紫杉醇（paclitaxel）是从短叶紫杉树皮中提取的具有抗癌活性物质， 为一种新型的抗微管药物[1]。紫杉醇的作用机制为：促进微管双聚体装配成微管， 并通过干扰去多聚化过程而使微管的稳定， 从而抑制微管网正常动力学重组， 导致细胞分裂受阻。此外， 本药还具有放射增敏效应， 可促进离子照射所致细胞损害[2， 3]。临床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症的治疗[4， 5]。药物含量是评价药品质量的重要指标之一， 为保证紫杉醇注射液的质量， 实现临床用药安全可靠， 作者尝试建立高效液相色谱法（HPLC）测定其含量。该方法准确， 重复性好， 专属性强， 与中国药典2010年版收录的紫杉醇含量测定方法相比较， 具有简便、快速的优点。

1 仪器与试药

岛津LC-15C高效液相色谱仪；岛津SPD-15C Essentia uv/vis检测器；岛津工作站LC-solution；AR 1140 型电子天平（梅特勒·托利多仪器有限公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AUW 120D 型电子天平（日本岛津公司）。

紫杉醇对照品（许昌恒生药业有限公司提供， 纯度>99.9%， 批号为A0177）；紫杉醇注射液（购于江苏红豆衫药业有限公司， 规格5 ml/30 mg， 批号分别为20130801， 20130805， 20130809）；甲醇（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；乙腈（色谱纯）（天津市四友精细化学品有限公司）；其它试剂均为分析纯， 水为超纯水。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长227 nm， 柱温35℃， 流速为1.0 ml/min， 进样量为20 μl， 流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）。

2. 2 对照品溶液的配制 精密称取紫杉醇对照品适量， 置于10 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得浓度为500 mg·L-1对照品贮备液。

2. 3 样品溶液的制备 分别取批号为20130801， 20130805， 20130809的3批紫杉醇注射液适量， （相当于紫杉醇6 mg）置于100 ml容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀即得。

2. 4 专属性试验 紫杉醇对照品（A）和样品中紫杉醇的HPLC图（B）， 见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）

2. 5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml， 分别置于10 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 得到对照品浓度分别为10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；进样， 记录峰面积值。以对照品浓度（X）为横坐标， 对照品峰面积（Y）为纵坐标， 进行线性回归， 得回归方程：Y=40555X-34526， R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10～125 mg·L-1时线性关系良好。

2. 6 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液， 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次， 其峰面积的RSD为0.17%（n=5）。

2. 7 稳定性试验 取“2.3”项下样品溶液（批号：20130805）在室温避光下放置， 分别于0、2、4、6、8、12 h时， 在仪器不关闭状态下测定不同时间内的含量。结果， 样品含量的RSD为0.26%（n=6）， 表明样品溶液在12 h内稳定性好。

2. 8 加样回收率试验 精密量取已知含量批号为20130805的紫杉醇注射液适量（相当于紫杉醇3 mg）， 分别精密加入紫杉醇对照品适量， 置于100 ml容量瓶中， 用乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表1。

2. 9 样品含量测定 将3批样品溶液分别按“2.1”项下实验条件进样， 结果见表2。

2. 10 有关物质检查 采用不加校正因子的主成分自身对照法。精密称取紫杉醇适量， 置10 ml 容量瓶中， 加乙醇稀释并定容至刻度， 摇匀， 制成200 mg·L-1的溶液作为供试品溶液；取供试品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中， 加流动相稀释至刻度， 作为对照溶液。取对照溶液20 μl进样， 调节检测灵敏度， 使主峰高达到记录仪满量程的10%左右， 再取供试品溶液进样20 μl， 记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。扣除溶剂峰和辅料峰， 量取色谱图上紫杉醇色谱峰外各杂质的峰面积总和， 并与对照溶液主成分的峰面积比较， 计算杂质含量。结果见表2， 3批样品中有关物质均<1.2%。

3 讨论

应用紫外分光光度计对紫杉醇在190～400 nm范围内扫描， 结果显示紫杉醇在227 nm处有较强吸收。作者采用227 nm作为该分析方法的检测波长， 可获得较高灵敏度， 基线平稳， 良好的峰形。

为了得到一个良好的分析效果， 作者在试验中对流动相进行了优化。试验分别考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-乙腈-水系统， 结果发现以甲醇-乙腈-水系统为流动相， 在选定的检测波长条件下， 基线稳定， 能够得到良好的峰形， 最终确定流动相为甲醇-乙腈-水（45：30：25， v/v）为该分析方法的流动相。总之， 本方法操作简便、准确度高、重现性好， 可用于紫杉醇含量的测定与质量控制。

参考文献

[1] Jared Bushman， Asa Vaughan， Larisa Sheihet， et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release， 2013，171（3）：315-321.

[2] 赵惠.紫杉醇周围神经毒性临床观察.中国实用医药， 2008， 3（13）：136-137.

[3] 龚奎玉，王志东，李建璜.中国实用医药， 2008，3（21）：73-75.

[4] Michela Di Michelea， Simone Marconea， Lucia Cicchillitti， et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines： Towards the identification of putative biomarkers.Journal of Proteomics， 2010，73（5）：879-898.

[5] Rong Liua， Denis M. Gilmorea， Kimberly Ann V. Zubris， et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic.Biomaterials， 2013，34（7）：1810-1819.