张涛 张胜逆 李靖华 张爱民 杨季红 程树杰

先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations，ARM)是小儿常见的消化道畸形，ARM发生的病理机制十分复杂，许多学者对动物和人类胚胎肛门直肠正常以及异常的发育过程进行了研究，目前仍没有完全阐明正常肛门直肠胚胎发育的演变规律，对ARM具体的胚胎发生机制更是知之甚少［1－3］。胚胎期肛门直肠的形态演变和构型改变依赖于细胞定向分化、增殖及细胞凋亡的协同作用。前人研究显示，在小鼠肛门直肠的胚胎发育过程中，细胞增殖(凋亡)在泄殖腔分离、肛膜及尿生殖膜崩解中发挥了重要作用［4，5］。而细胞增殖(凋亡)是否也参与了人类肛门直肠的发育，至今未见相关研究报道。本研究应用3～9周人胚标本，结合PCNA免疫组织化学及TUNEL技术染色分析细胞增殖(凋亡)的时空分布规律，初步探讨细胞增殖(凋亡)在肛门直肠胚胎发育中的作用。旨在更深入地认识肛门直肠胚胎发育过程，为进一步阐明ARM的发生提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂 本研究遵守赫尔辛基宣言，收集因意外妊娠而进行人工流产，发育正常的人胚胎标本108例(每例标本均取得产妇本人同意)。根据产妇末次月经时间、Carnegie stages人胚胎形态发育特征和超声所测胎儿头臀长、双顶径等确定胎龄为3～9周。标本经4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液4℃固定12～24 h，常规脱水制成蜡块，行矢状面连续切片。见表1。

表1 不同胎龄的标本分布

1.2 方法 3～5周胚胎取整个胚胎，6～9周胚胎取其盆部，标本经0.01 mol/L PBS液冲洗后立即置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定12～24 h，常规脱水，石蜡包埋。石蜡标本进行矢状面连续切片，厚度4 μm，在显微镜下观察未染色切片，在观察到泄殖腔或直肠膀胱出现时连续保留切片，连续切片TUNEL和PCNA的免疫组化染色，免疫组化实验采用SP法。Nikon E800成像系统拍照。采用NIS-Elements Basic Research多媒体彩色病理图像分析系统连续对比观察不同胎龄人胚的泄殖腔、尿直肠隔、直肠、膀胱和尿道发育情况及其相互间的关系。对TUNEL、PCNA的表达进行定位观察分析，每张切片分别观察40倍，100倍及400倍视野图像，来判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势。

2 结果

2.1 凋亡细胞观察 第6周，凋亡细胞主要位于肛门直肠、尿直肠隔及尿生殖窦的上皮;尤其是在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞;第7周，凋亡细胞大量分布于直肠末端和直肠背侧间质区;第8周，直肠及肛管上皮中可以见到凋亡细胞，而在尿直肠隔背侧与泄殖腔膜内仅观察到少量的凋亡细胞。见图1A～C。

图1 胚胎6～8周时，凋亡细胞在肛门直肠区的时空分布特点:A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直肠隔;VCM，腹侧泄殖腔膜;R，直肠;U，尿道(TUNEL染色，主图×40，嵌图×400)

图2 胚胎6～8周时，增殖细胞在肛门直肠区的时空分布特点:A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直肠隔;VCM，腹侧泄殖腔膜;R，直肠;U，尿道(PCNA免疫组化染色，主图×40，嵌图×400)

2.2 增殖细胞观察 第6周，肛门直肠、尿生殖窦及尿直肠隔上可以观察到微弱的增殖细胞;散在的增殖细胞位于背侧泄殖腔膜;第7周，尿直肠隔间质中可见增殖细胞出现，这些细胞大部分位于肛门直肠和尿直肠隔腹侧的间质内;第8周，增殖细胞主要分布于尿道和肛门直肠的上皮中，同时在尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜的融合区域内有大量增殖细胞的聚集。见图2A～C。

3 讨论

ARM是小儿外科常见的先天性消化道畸形，其发生率1/5 000～1/1 500，是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一。其病理类型极其复杂，从单纯的肛门闭锁到严重的泄殖腔畸形等，给患者带来极大的痛苦，引起各国研究者的高度重视。在本研究中，我们通过连续动态观察肛门直肠的发育过程，提出了一些新观点，如尿直肠隔与泄殖腔膜的关系;背侧及腹侧泄殖腔膜分别与肛门直肠和尿生殖窦及会阴发育的关系;细胞凋亡(增殖)在肛门直肠发育中的时空分布特点等。

尿直肠隔与泄殖腔膜在泄殖腔向肛门直肠发育过程起到了重要的作用，而尿直肠隔是否与泄殖腔膜融合是目前争论的焦点之一［4，5］。Van der Putte［6］通过对猪和人的胚胎形态学研究发现:泄殖腔分隔过程中，泄殖腔背侧连同其间质成份向尾沟移动，上皮细胞和泄殖腔膜向腹侧延伸的同时，背侧泄殖腔膜逐渐变薄破裂，形成肛门直肠对外界的开口。Kluth等［3］认为泄殖腔正常发生过程中产生了尿直肠隔这一结构，但未观察到尿直肠隔与泄殖腔膜的融合，并且强调在此过程中泄殖腔构型变化的重要性。Paidas等［7］认为尿直肠隔与泄殖腔膜的距离的进行性减小是泄殖腔构型变化的结果，伴随着胚胎的生长、伸展、旋转、尿直肠隔和泄殖腔膜距离不断减小，未观察到尿直肠隔和泄殖腔膜的融合。在本研究中，我们注意到肛门直肠的生长发育与其毗邻组织的形态、空间位置之间存在密切联系。本研究显示胚胎3～5周，尿生殖窦周围的间质与肛门直肠区间质的不对称性发育，泄殖腔发生位置和构象的重大改变;同时使得尿直肠隔在发育过程中不断接近泄殖腔膜，其间隙变得越来越狭小。而在胚胎5～7周时，随着背侧泄殖腔向尾沟的不断接近，泄殖腔逐渐缩小;背侧泄殖腔膜在第7周时崩解，直肠自此与羊膜腔相通，这清楚的表明在人类胚胎肛门直肠发育过程中并未发现尿直肠隔与背侧泄殖腔膜的融合。同时我们还发现，泄殖腔膜腹侧部分较背侧部分明显为厚，此结果提示在泄殖腔膜的整个胚胎发育过程中存在着不均衡性的特点。由此我们推测，人胚泄殖腔的发育严格遵循时空动态变化的规律:在早期胚胎发育中，背侧泄殖腔膜对于正常肛门直肠的发育发生发挥着极其重要的作用。

此外，在本研究中，还有一个现象值得密切关注:在背侧泄殖腔膜崩解后，尿直肠隔进一步向头侧及腹侧移位，向生殖结节延展，与腹侧泄殖腔膜融合，直接参与了尿道近-远轴的建立，其间质参与了会阴体的形成。值得注意的是，到目前为止，尽管在泌尿生殖道研究领域有研究指出腹侧泄殖腔膜参与了尿道的构成，但是均未明确的指出腹侧泄殖腔膜与尿直肠隔的融合这一重要现象［8－10］，使得人们忽视了腹侧泄殖腔膜在参与泌尿生殖道构成中所发挥的作用。这一发现提示腹侧泄殖腔膜在泌尿生殖道和会阴的胚胎发育中具有重要意义，特别是在保持尿道完整性方面发挥了不可忽视的作用。本研究观察到的现象对早期泄殖腔发育中存在长久争议的事件提供了重要的形态学证据，进一步说明腹侧和背侧泄殖腔膜分别在正常的泌尿生殖系统和直肠发育中发挥了至关重要的作用。

肛门直肠形成过程众多生物学事件参与其中，如细胞分化，增殖，凋亡，转化和粘附。在本研究中，我们首先探讨肛门直肠发育中细胞凋亡所发挥的作用。第6周时，凋亡细胞主要分布于尿直肠隔背侧间质和背侧泄殖腔膜，尿直肠隔间质内及泄殖腔膜的凋亡细胞背侧部分比腹侧部分明显，而此时正是尿直肠隔头腹侧旋转的关键时期，故推测尿直肠隔背腹侧不均衡的细胞凋亡是导致尿直肠隔的头腹侧旋转潜在机制之一。而尿直肠隔的头腹侧旋转是泄殖腔构型变化重要的一部分，是保证肛门直肠向尾沟下降的关键因素之一。在实验中，我们同样观察到第6周时(图4A)，在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞，使得肛膜裂解，直肠与外界相通是凋亡作用的结果，基本与前人的研究［11，12］一致。第7周时，凋亡细胞大量分布于直肠末端和直肠背侧间质区，进一步证实在肛门直肠形成过程中凋亡的重要作用(图4B)。从第8周，少量的凋亡细胞分布于尿直肠隔背侧间质，这可能与后期的尿直肠隔向头腹侧进一步旋转密切相关(图4C)。总之，细胞凋亡在肛门直肠的发育过程中发挥了主导作用，背侧泄殖腔膜的凋亡与背侧泄殖腔向肛门直肠发育存在密切的关系。

细胞增殖与凋亡相辅相成共同调控胚胎形态发生［11－13］。与 van der Putte［13－15］研究相比较，在本研究中，可以观察到胚胎6～7周，尿直肠隔腹侧增殖较背侧显著，促进了尿直肠隔向头腹侧的旋转，泄殖腔膜也因此出现空间位置上从垂直位到水平位的转化，引起了背侧泄殖腔向尾沟的进一步接近。到胚胎第8周，增殖细胞集中出现于尿直肠隔腹侧加快了其向头腹侧的旋转，促进了与腹侧泄殖腔膜的融合。所以我们认为:细胞增殖不但在肛门直肠发育中发挥了重大作用，而且对泌尿生殖道和会阴的胚胎发育也有重要的影响。我们推测，凋亡和增殖双重作用参与了尾端器官的胚胎发生，也表明细胞凋亡和增殖异位分布可能会干扰正常肛门直肠和泌尿生殖道的发育。目前认为，在肛门直肠形成的关键时期众多生物分子参与了细胞凋亡和增殖的调控，如 Wnt5a［16，17］、Shh 信号通路［18］、Hoxd-13［19］、Cdx1［20］以及 Tcf4［21］等均在胚胎发育时表达于背侧泄殖腔膜上。在调控信号异常表达的情况下，背侧泄殖腔膜在特定时间内的细胞增殖、转化和细胞凋亡发生紊乱，导致背侧泄殖腔膜发育不良，背侧泄殖腔向尾沟的迁移发生障碍，从而引发ARM。

结合人类肛门直肠胚胎发育、ARM动物模型及临床ARM的类型，我们综合分析后提出，胚胎不同阶段、泄殖腔及其毗邻结构的发育障碍/异常与ARM的严重程度和临床类型存在一定联系。肛门直肠畸形的胚胎发生和其他畸形的发生一样，可能与妊娠期，特别是妊娠早期(4～12周)受到某些致畸因素如病毒感染、化学物质、环境及营养等作用有关。胚胎期发生障碍的时间越早，所致畸形的位置越高、越复杂。若孕期干扰因素出现在胚胎发育早期，可能会出现泄殖腔畸形、尾端发育不良等严重畸形;在胚胎5～8周时，背侧泄殖腔膜发出异常的调控信号则可能使背侧泄殖腔向腹侧移位，将引起各型泌尿生殖道瘘，同时盆底肌发育缺陷也继发出现;若干扰因素出现在8周左右，则引发的畸形会相对较轻(肛门狭窄、肛门闭锁等)。干扰因素出现于8周以后可能使得会阴及泌尿生殖道发育障碍，若尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜不能融合则可引起URSM畸形;腹侧泄殖腔膜向尿道的延伸异常可能引起尿道下裂等畸形。由此我们认为，人胚泄殖腔发育严格遵循着时空动态变化的规律:在早期胚胎发育中，背侧泄殖腔膜对于正常肛门直肠的发育发生发挥着极其重要的作用。然而由于孕期干扰因素的出现，胚胎发育缺陷，干扰了正常的背侧泄殖腔及背侧泄殖腔膜的发育，背侧泄殖腔膜发育异常，背侧泄殖腔构象异常，肛门直肠的开口位置异常，而异位的后肠开口位置的不同可能与背侧泄殖腔膜发育障碍的程度密切相关。背侧泄殖腔膜及背侧泄殖腔整体发育缺陷是ARM出现的形态学基础，背侧泄殖腔膜及背侧泄殖腔的发育缺陷程度决定了ARM程度。

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