何宴清 杨萍 文莉 郑雪松 肖丽

目前，糖尿病已经成为威胁公众健康的主要疾病之一，其最不利的并发症是糖尿病肾病(DN)，与肾功能损害和心血管疾病风险增加相关的临床综合征［1］。各种类型的糖尿病其糖尿病肾病是随着时间逐渐进展。最早检测的标志是微量白蛋白尿和组织病理学改变包括细胞外基质的沉积，肾小球基底膜增厚，肾小球系膜扩张［2］。最后大量蛋白尿的出现，其次是一个渐进的肾小球滤过率下降和肾小球足细胞的损失，肾小管间质纤维化，肾小球硬化，小动脉玻璃样变。预防或阻止糖尿病肾病进展，严格控制血糖和高血压是关键因素［3］。然而，即使对糖尿病患者控制肾脏疾病健康教育，有相当数量的患者不仅发展为糖尿病肾病，而且进展为慢性肾脏病。因此，延缓或逆转糖尿病将是非常必须的［4］。本研究通过测定2型糖尿病肾病患者T细胞的比例，分析在2型糖尿病肾病的发病与细胞之间的关系，明确外周血细胞在慢性肾脏性疾病的发生发展过程中的所起的作用，为临床应用提供依据，并为干细胞治疗糖尿病深入研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月至2013年1月在我院肾病内科住院的终末期肾病患者100例，根据是否合并糖尿病分为2组:糖尿病合并终末期肾病组55例，男30例，女25例;终末期肾病组45例，男23例，女22例，为终末期肾病无糖尿病病史。糖尿病组为50例2型糖尿病患者无肾病病史。同时选取体检中心的60例健康体检者作为健康对照组。4组一般资料比较有可比性。见表1。

表1 4组一般资料比较±s

表1 4组一般资料比较±s

组别 年龄(岁) BMI(kg/m2) 血压(mm Hg) 胆固醇(TC，mmol/L) 三酰甘油(TG，mmol/L)糖尿病合并终末期肾病组(n=55)52 ±0.4 25 ±0.8 120/8 ±10/6 4.65 ±1.02 1.6 ±0.8终末期肾病组(n=45) 51 ±0.5 24.5 ±0.5 116/75 ±8/4 4.24 ±0.08 1.5 ±0.5糖尿病组(n=54) 49 ±0.3 25.8 ±0.7 124/75 ±9/5 5.05 ±0.07 1.6 ±0.8健康对照组(n=60) 53 ±0.2 24.6 ±0.4 118/7 ±10/6 4.95 ±0.05 1.6 ±0.6

1.2 方法 实验检测指标:留取清晨所有被检查者的随机尿，并抽取空腹静脉血，检测TC、血肌酐(Scr)、TG、空腹血糖(Glu)、糖化血红蛋白(HbA1c)、餐后2 h血糖(2 hFPG)、留取2 ml外周血测定细胞在单核细胞中的比值等。(1)白蛋白尿:留取的尿样应用测尿微量白蛋白应用氧化酶法检测尿肌酐(Cr)。(2)肾小球滤过率估计值(eGFR):Scr(日本Hitachi)应用氧化酶法检测，以全国肾小球滤过率估计值课题协作组开发的适合中国人群的改良MDRD公式计算估算肾小球滤过率(eGFR)［ml·min－1·(1.73 m－2］=175 × (HitPcr)－1.234×(年龄)－0.179×(0.79女性)。HitPcr为用Hitachi7170分析仪检测的血肌肝。Scr的单位为mg/dl，年龄的单位为岁，eGFR的分期参照 K/DOQI的分期标准［5］。(3)细胞测定:密度梯度离心法分离外周单一核细胞及去除幼稚红细胞，过滤用4～5号针头，体积稀释用含有10%FBS的分离缓冲液。加于淋巴分离液时，试管需倾斜45°(淋巴分离液与标本体积比为1∶2)，离心30 min后，用吸管吸取中间层，将其等体积混匀与分离缓冲液，离心20 min弃去上清液，1 ml分离缓冲液加入并混匀，红细胞裂解液加3～5 ml，2 min裂解，离心20 min，弃红色上清。至少1 ml加分离缓冲液再混匀。EP管中加入吸取100 ml混匀的免疫磁珠，磁力将磁珠吸附于管壁，吸去多余液体，取下后加1 ml分离缓冲液混匀，1 min吸去液体取下，再置MPC磁力架上，加分离缓冲液至磁铁高度重悬细胞置于MPC磁力架上，在磁珠的带动下和磁珠结合的细胞吸附于EP管壁，吸去上清2 min后，反复3次后，并加入100 ml EDTA，涡旋2～3 s，室温下轻轻旋转孵育45 min后，细胞与磁珠在EDTA作用下分离，置于MPC磁力架上2 min加2 ml分离缓冲液涡旋2～3 s，EP管壁被磁珠吸附，而细胞再次分布于液体中，新EP管吸取液体，MPC磁力架上反复3次后，混匀后置室温孵育30 min，用PBS洗3遍弃上清液，将细胞重新悬浮于500单位PBS中进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，采用非配对资料t检验;计数资料的比较用χ2检验;CKD相关危险因素的分析采用二分类非条件Logistic回归分析;多组资料的检验采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表2 4组外周血CD+34/单核细胞比值%，±s

表2 4组外周血CD+34/单核细胞比值%，±s

注:与健康对照组比较，*P ＜0.05;与糖尿病组比较，#P ＜0.05

组别CD+34/PMNC健康对照组(n=60)0.094 ±0.032糖尿病组(n=50) 0.075 ±0.022*终末期肾病组(n=45) 0.038 ±0.020*#糖尿病合并终末期肾病组(n=55) 0.035±0.020*#

2.2 4组FPG、2 hFPG、HbA1c水平比较 健康对照组与糖尿病组、糖尿病合并终末期肾病组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与终末期肾病组比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与终末期肾病组、糖尿病合并终末期肾病组比较有统计学意义(P＜0.05);终末期肾病组与糖尿病合并终末期肾病组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 4组FPG、2 hFPG和HbA1c水平比较±s

表3 4组FPG、2 hFPG和HbA1c水平比较±s

注:与健康对照组比较，*P ＜0.05;与糖尿病组比较，#P ＜0.05;与终末期肾病组比较，△P ＜0.05

组别 FPG(mmol/L)2 hFPG(mmol/L) HbA1c(%)健康对照组(n=60)4.3 ±0.8 7.2 ±0.6 4.9 ±0.5糖尿病组(n=50) 8.0 ±2.1 9.8 ±2.3 8.5 ±0.6终末期肾病组(n=45) 5.7 ±1.2# 8.3 ±2.4# 5.6 ±0.9#糖尿病合并终末期肾病组(n=55) 9.5±3.0*#△ 13.6±3.6*#△ 10.5±0.7*#△

2.3 4组患者微量白蛋白、Cr、eGFR比较 终末期肾病组及糖尿病合并终末期肾病组微量白蛋白、Cr、eGFR与健康组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。糖尿病组与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，糖尿病组与终末期肾病组及2型糖尿病合并终末期肾病组微量白蛋白、Cr、eGFR差异有统计学意义(P＜0.05)。终末期肾病组及糖尿病合并终末期肾病组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 4组患者微量白蛋白、Cr、eGFR比较±s

表4 4组患者微量白蛋白、Cr、eGFR比较±s

注:与健康对照组比较，*P ＜0.05

组别 Cr(μmol/L) 微量白蛋白(mg/L) eGFR(%)健康对照组(n=60) 60±6 5.4±2.9 98±7*糖尿病组(n=50) 80±8 6.9±3.2 95±8*终末期肾病组(n=45) 795±8* 1 014.3±50.2* 9.0 ±0.8*糖尿病合并终末期肾病组(n=55) 804±10* 986.1±40.0* 9.5 ±1.2*

表5 CD34+细胞与各指标相关分析

3 讨论

糖尿病肾病是随着时间逐渐进展。最早检测的标志是微量白蛋白尿和组织病理学改变包括细胞外基质的沉积，肾小球基底膜增厚，肾小球系膜扩张。最后大量蛋白尿的出现，其次是一个渐进的肾小球滤过率下降和肾小球足细胞的损失，肾小管间质纤维化，肾小球硬化，小动脉玻璃样变［6］。National等［7］分离外周血的单核细胞通过磁珠选择法，在体外分化成内皮细胞证实细胞是其中的一种血管内皮前体细胞，可来反映血管内皮功能的变化通过检测细胞水平，预测血管的反应性通过外周血的水平可以更好反应。Zuo等［8］研究表明其预测肾脏血管内皮功能早期损伤终末期肾病患者的细胞、黏附因子1增高、细胞均降低。Cepeda等［9］发现肾病患者动员到外周血中，证实患者的血管内皮功能可能细胞恢复作用有关。Yang等［10］发现细胞与肾病患者的免疫复合物程度呈负相关。由此推出测定细胞在肾病发病及发展过程中极为重要，在治疗方面，外周干细胞已被证明分化或转分化为肾系膜细胞、肾小管上皮细胞内皮细胞与足细胞［11－15］。此外，外周间充质干细胞可能交叉生殖细胞屏障和内产生细胞和外胚层血统。外周间充质干细胞促进组织再生，不仅因为其分化潜能，间充质干细胞清除氧化应激作用［16］。外周间充质干细胞具有很强的体外培养和电离辐射，产生强烈的氧化应激。活性氧和活性氮物种的有害影响外周间充质干细胞的低敏感性与这些细胞的有效清除过氧化氢和过氧亚硝基阴离子的能力有关［17］。此外，外周间充质干细胞具有解毒酶活性物种的主要机制，防止氧化损伤的蛋白质组和基因组间充质干细胞在正常周转和包括肾血管肾结构重塑中发挥了关键作用［17－20］。

本文对60例健康者，50例2型糖尿病患者，55例2型糖尿病患者合并终末期肾病患者及45例终末期肾病患者进行了对比研究，得出2型糖尿病患者外周血水平低于健康对照组，这可能与2型糖尿病患者血管病变有关。终末期肾病患者外周血细胞与单核细胞的比值低于健康对照组，表明的水平可以作为血管反应性的一个预测因子;2型糖尿病合并终末期肾病患者外周血水平与终末期肾病组差异无显著性意义，表明在肾脏疾病的发生及发展过程中，血管内皮功能紊乱起到很重要的作用，本文结果表明外周血中/PMNC值与2型糖尿病合并终末期肾病的危险因素密切相关:外周血值与FPG、2 h FPG及 HbA1c呈负相关(P＜0.05)。表明细胞与血糖波动密切相关，血糖波动可能影响细胞的变化，从而可能导致内皮功能的紊乱，加重血管病变。本文还证实尿微量白蛋白及肌酐水平是值的影响因素之一(P＜0.05),细胞可能是终末期肾病的危险因素受到影响从而参与 肾病的发生及发展，监测细胞水平的变化也许可以用来预测2型糖尿病合并肾病发生。同时观察细胞在慢性肾脏性疾病的发生发展过程中的所起的作用，为临床应用提供依据，并为干细胞治疗糖尿病深入研究奠定基础。

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