叶迎宾 黄秀香 李军 章健 田楠楠 王秀芹 赵斗贵

原发性肝癌(PHC)在我国已成为第二恶性肿瘤，有56%的癌症患者为肝癌。普遍认为肝癌的发生是一个包括癌基因激活和抑癌基因失活的多因素、多步骤过程［1］。但关于肝癌的确切病因尚不清楚。在我国主要以病毒性肝炎(HBV、HCV)的慢性持续感染是肝癌发生的主要背景，乙型肝炎相关者占70% ～80%，丙型与丁型肝炎相关者为15% ～20%［2］。约5%的肝癌可能与黄曲霉毒素、饮用水污染、遗传因素等有关［2］。往往当发现肝癌时，大多错过最佳的治疗时间，如何能及早发现肝癌呢?当务之急就是要找到一种对肝癌细胞灵敏度和特异性高的标志物［如甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高尔基体糖蛋白73(GP-73)］。本文通过对肝癌患者的AFP-L3、GPC3、GP-73的检测数据的分析，探讨三者联合检测来诊疗肝癌的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年5月至2012年12月，在我院肝病科住院且经病理学或符合AFP诊断标准证实的肝癌患者154例(肝癌组)，其中男95例，女59例;年龄36～76岁，平均年龄53.9岁。肝硬化患者78例(肝硬化组)，其中男56例，女22例;年龄30～66岁，平均年龄48.3岁。肝硬化患者诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》［3］中肝硬化诊断标准。肝癌诊断符合原发性肝癌诊疗规范(2011年版)［4］。正常体检者56例为对照组，其中男39例，女17例;年龄20～36岁，平均年龄25.4岁。

1.2 仪器与试剂 仪器为Thermo公司的 MK3酶标仪(简称“酶标仪”);AFP-L3、GPC3、GP-73试剂盒均由上海雅吉生物科技有限公司提供。检测AFP的仪器为西安核仪器厂提供的XH-6080十探头全自动智能γ免疫计数器，其试剂盒有北京北方生物技术研究所提供，严格按照说明书操作。

1.3 检测方法 取被检者空腹静脉血5 ml，分离血清，置－20℃冰箱保存备用。AFP-L3、GPC3、GP-73三者检测均采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作。用酶标仪检测其OD值，根据标准浓度曲线图，分别计算出其浓度。AFP检测采用放射免疫法，AFP＞20 μg/L，AFP-L3% ＞10%视为阳性;GPC3检测值 ＞3.0 μg/L 视为阳性;GP-73 检测值 ＞150 μg/L 视为阳性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以表示，组间数据比较采用方差分析，进一步两两比较采用采用t检验(LSD)。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)来确定最佳临界值，计算ROC曲线下的面积(AUG)，采用单样本t检验比较AUG、敏感度和特异度，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组中血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP比较 PHC组血清指标检测结果与肝硬化组和对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。3组中相同项目两两比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 3 组血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

表1 3 组血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

注:与肝癌组比较，*P ＜0.01;与肝硬化组比较，#P ＜0.01

组别 AFP(μg/L) GP-73(μg/L)GPC3(μg/L) AFP-L3(μg/L)AFP-L3/AFP(%)肝癌组(n=154) 2 124±2 183 174±54 10.7±3.1 338.6±379.2 13.8±4.0肝硬化组(n=78) 84±49* 82±36* 2.7±0.7* 6.4±2.8* 8.8±3.9*对照组(n=56) 11±6*# 17±13*# 1.3±0.6*# 0.7±0.6*# 6.3±2.7*#F值63.1 266.9 411.1 56.3 126.8 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 GP-73、GPC3和 AFP-L3三者联合检测结果

GP-73、GPC3和AFP-L3三者中有一项为阳性即为联合检测阳性(并联实验)，敏感度97.9%(282/288)，特异度 79.5%(105/132)，准确度 87.5%(387/442)。三者的敏感度和准确度高于任何两者联合和单项的敏感度和准确度(P＜0.05)，特异度差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 GP-73、GPC3和AFP-L3单项和联合检测对PHC的诊断价值比较 %(例)

2.3 血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 的含量对 PHC的诊断价值 以AFP-L3＞10%为判断标准，根据ROC曲线结果，以诊断PHC的灵敏度与特异度之和的最高值确定临界值，血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3诊断PHC 的临界值分别为 1 255.0、162.5、9.7 和 119.2。见图1、表3。

图1 AFP、GP-73、GPC-3和AFP-L3检测诊断原发性肝癌的ROC曲线

表3 GP-73、GPC-3和AFP-L3检测对PHC的诊断价值 %(例)

2.4 不同AFP水平的肝癌组的GP-73、GPC3、AFP-L3的阳性变化 GP-73在肝癌组不同AFP水平的变化差异有统计学意义(P＜0.05)。AFP-L3(%)在肝癌组不同AFP水平的变化差异有统计学意义(P＜0.05)。GPC3的差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 不同AFP水平在肝癌组中GP-73、GPC3、AFP-L3%的阳性率

3 讨论

AFP是目前临床上最主要、应用最广泛的PHC早期筛查血清标志。但是有1/3的慢性肝病、肝纤维化和肝硬化出现AFP不同程度的升高，有1/3的PHC患者不升高［5］。导致AFP的敏感度和特异度不高，不能满足临床需要。由于不同研究的设计方案不同、样本量差异、AFP临界值设定不同等多方面原因造成敏感性有差异［6］。本文以AFP-L3% ＞10%为标准，AFP诊断PHC的临界值为1 255.0 μg/L，远大于参考区间(0～20 μg/L)，敏感度为48.1%，特异度为100%。可能与标本的收集或者检测方法有直接关系，有待进一步论证。

AFP-L3为肝癌细胞特异产生，表达AFP-L3的肝癌细胞有早期血管浸润和转移的倾向，ALF-L3%(AFP-L3/AFP)越高提示肿瘤的恶性程度越高［7］。丁贤等［8］报道，表明AFP-L3用于肝癌的诊断不受AFP≥400 μg/L作为肝癌诊断标准的限制，当AFP-F3%＞10%而AFP轻度升高提示发生肝癌的可能性较大。由于AFP-L3%不受AFP水平的影响，因此检测AFPL3%是AFP低浓度持续阳性患者及小肝癌AFP尚未明显升高时早期预报肝癌发生的重要指标［9］。何建伟等［10］报道AFP-L3%非常适用于PHC和肝硬化鉴别诊断，同时也适用低浓度AFP持续阳性的良、恶性肝病的鉴别诊断。从表4中得知，肝癌组中随着AFP水平越高AFP-L3%的阳性(59.1%)率越高，与其他3个水平相比，差异有统计学意义(F=8.842，P=0.000)。在PHC和肝硬化的鉴别诊断，ALP-L3运用具有明显的优势(F=126.8，P=0.000)。

GPC3是一类细胞表面的糖蛋白，参与调节细胞生长、发育、分化和迁移等行为，在机体的生长、发育中起着重要的作用［11］。2010年7月由 Bruix等［12］共同指出，小病灶的肝活组织病理学检查不能确认为HCC的组织，应用所有可用标志物之一的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3进行染色，以提高诊断准确性。宋孟锜等［13］指出，GPC3在肝癌组织表达高于癌旁和正常肝组织，GPC3与肿瘤大小、肿瘤数目、HBsAg及AFP水平无明显相关，而与病理分级和临床分期有关。到目前为止，本次实验结果中，PHC组的GPC3明显高于肝硬化组和正常对照组，与后者相比差异有统计学意义(F=411.1，P＜0.01)。虽然 GPC3随 AFP的水平升高而阳性率增多，但差异无统计学意义(F=2.222，P＞0.05)。文献多次报道提示临床要慎重对待高于正常肝组织的GPC3的检测值，要科学合理地进行检查，防止漏检，进而提高肝癌的诊治率［14－16］。

GP-73是存在于高尔基体的一种跨膜糖蛋白，在正常的人体肝组织中主要由胆管上皮细胞表达，而肝细胞表达很少甚至不表达。在急、慢性肝炎或肝硬化中，GP-73表达明显升高［17］。本实验中，肝癌组明显高于肝硬化组和正常对照组(F=266.9，P＜0.01)，与曾经的文献报道［18－20］一致。在AFP不同水平中肝癌组的GP73阳性率高于肝硬化组和对照组，差异有统计学意义(F=2.977，P＜0.033)，说明血清中GP73的浓度与AFP的水平有关，这与Sun等［21］报道不同，后者指出血清GP73与肿瘤大小、分化程度无相关，本实验结果有待进一步证实。

多项肿瘤标志物联合检测可降低有单一标志物所致的漏诊和误诊，能有效提高诊断的准确率，弥补单项的不足［22，23］。检测本实验结果显示，三者联合检测GP-73、GPC3和 AFP-L3%的敏感度(97.9%)和准确度(87.5%)较单独检测或任两项联合检测高，差异有统计学意义(P＜0.05)，但特异度较低。联合检测对肝癌早期诊断及AFP阴性肝癌的筛选有很多的临床意义，也有助于良恶性肝病的鉴别［24］。房萌等［5］报道GP-73在肝硬化中显著上升，作为PHC诊断标志应需临床大量标本进一步验证。马桂英等［25］研究显示有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平也可增高，故仅检测AFP易造成漏诊和误诊。从表4中显示，GP-73和AFP-L3在肝癌组不同AFP水平的变化差异有统计学意义(P＜0.05)。当 AFP≤400 μg/L不能确诊肝癌时，可以检测 GP-73、GPC3和AFP-L3对AFP的不足做出弥补，达到早发现、早治疗的效果。GP-73、GPC3和AFP-L3在肝癌中的含量明显高于肝硬化组，这说明肝硬化向肝癌转化的过程中，定期观察标志物的浓度变化对肝癌早期的判断提供重要的依据。

总之，肝癌是一种复杂性的疾病，单一的高特异性和敏感性的生物标志物不可能检测所有的肝癌患者［26］。多项肿瘤标志物能提高原发性肝癌的诊断率，因此我们要通过大量试验组合的分析，发现具有高敏感度和高特异度的新型肿瘤标志物用于对早期肝癌的鉴别诊断。

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