张晓云，马巧玲，姜利群

（中国人民解放军第184医院检验科，江西 鹰潭 335000）

白色念珠菌耐药相关UPC2基因的研究进展

张晓云，马巧玲，姜利群

（中国人民解放军第184医院检验科，江西 鹰潭 335000）

本文综述了白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制、UPC2基因结构特征、UPC2基因编码产物的功能，指出白色念珠菌UPC2基因编码产物能对ERG基因以及某些药物外排泵蛋白基因表达发挥调节作用，从而诱导白色念珠菌对唑类药物产生耐药性。

白色念珠菌；UPC2基因；氟康唑；耐药

白色念珠菌(Candida albicans)是一种常见条件致病菌，通常存在于正常人皮肤、口腔、上呼吸道、肠道及阴道等黏膜部位[1]。患者处于机体免疫力下降、介入性治疗等情况下，白色念珠菌可侵袭机体，引起院内机会性感染[2]。近年来，随着广谱抗菌药物的滥用、器官移植免疫抑制剂应用、放化疗增多、各种生物装置体内置入和导管留置等，使得免疫功能低下者不断增多，白色念珠菌引起的医院内获得性感染呈增多趋势，已成为此类患者死亡的主要原因。国内学者报道，临床真菌感染患者中白色念珠菌感染占67.54%[3]。氟康唑、伏立康唑等唑类药物抗真菌谱广、毒性低、半衰期长[4]，临床上被广泛用于防治真菌感染。在药物选择性压力下，临床分离的白色念珠菌对常用抗真菌药物产生了一定耐药性，导致药物效能降低乃至失效，给临床用药安全带来了巨大挑战[5]。

1 唑类药物的作用靶点以及抗菌机制

胆固醇是高等生物细胞膜的重要组分，为细胞膜发挥功能所必需。麦角固醇是胆固醇的同功异构物，存在于真菌等真核细胞的细胞膜上，是此类细胞膜发挥功能所必需的固醇物质之一。白色念珠菌细胞膜上含有麦角固醇，是白色念珠菌生长所必须的组分。白色念珠菌细胞合成麦角固醇时，细胞色素p450复合体中的14α-羊毛固醇去甲基酶(Erg11p)是关键限速酶。Erg11p由白色念珠菌的ERG11基因(又名CYP51基因)编码[6]。一旦Erg11p酶活性受到干扰，细胞合成的麦角固醇减少，一方面导致胆固醇合成途径中的有毒中间体物质增加，另一方面造成细胞膜流动性以及细胞膜蛋白(例如参与细胞壁合成的酶以及转运蛋白等)活性发生改变，真菌细胞生长受到抑制乃至死亡[4]。唑类抗真菌药物的作用靶酶是Erg11p[7]。唑类抗真菌药与Erg11p的血红素铁活性中心结合后，Erg11p酶活性受抑，麦角固醇合成被抑制或阻断，引起真菌细胞作用生长受抑或死亡。

2 真菌对唑类药物的耐药机制

白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制主要如下：①药物作用靶酶(主要是Erg11p酶)基因突变或过度表达[8]，使得Erg11p酶活性未受明显影响，真菌细胞的麦角固醇合成继续维持，真菌继续生长。②药物外排泵基因表达上调，使得真菌细胞对药物的主动外排能力增强，减少了药物在真菌细胞内的累积[9]，真菌得以继续生长。白色念珠菌通过主动耗能方式将氟康唑从细胞内排出到细胞外，白色念珠菌多个基因表达产物参与了对药物的主动外排。白色念珠菌药物外排相关的泵蛋白主要包括两类[9]，一类是Abc转运蛋白，由CDR基因编码，含有ATP结合区；另一类是易化子家族蛋白，由MDR基因编码。白色念珠菌对药物的敏感性与药物外排泵蛋白基因表达水平有关。泵蛋白表达水平主要受到两类基因的影响：一类是药物外排泵蛋白编码基因，编码跨膜转运蛋白，这些蛋白负责将药物从细胞内排出到细胞外；另一类是转录因子编码基因，编码转录因子，对上述泵蛋白的编码基因表达发挥调节作用，直接影响泵蛋白表达水平，从而影响药物敏感性。

3 UPC2基因在真菌对唑类药物耐药中的作用

3.1 UPC2基因结构特征白色念珠菌UPC2基因属于一种转录因子编码基因，编码产物为Upc2蛋白(Upc2 protein，Upc2p)。Upc2p为一种转录调节因子，属于锌簇家族转录因子成员，含有2个锌离子和6个半胱氨酸残基，对白色念珠菌的多个基因表达具有调节作用转录调节功能[10]，如调节ERG11基因转录与表达。锌簇家族转录因子的其他成员参与调节白色念珠菌的其他新陈代谢活动，例如CAP1转录因子调节真菌细胞应对氧化应激压力，GAT1转录因子调节氮元素代谢，CPH1、EFG1、TUP1等转录因子参与调节菌丝形态转换[11]。UPC2基因5'端的启动子区域存在两个结构域：ATG上游的-450～-350 bp区域为UDR(Upc2p-dependent region)，ATG上游的-350～-250 bp区域为UIR(Upc2p-independent region)。UPC2基因启动子中的这两个元件都能够结合Upc2p，因此，UPC2基因表达水平受到顺式作用调节。接受转录因子Upc2p调节的靶基因的启动子区域带有固醇反应元件(Sterol response element，SRE)。SRE含有7 bp的保守核心序列，正义链为5'-TCGTATA-3'，反义链为5'-TATACGA-3'。体外实验表明，Upc2p带有DNA结合区域，能够与靶基因的SRE直接结合，从而激活靶基因，上调靶基因表达。真菌某些对唑类药物耐药基因也带有SRE元件，接受Upc2p的转录调节[12]。

3.2 UPC2基因编码产物Upc2p的功能Upc2p参与白色念珠菌对唑类药物耐药主要与两方面因素有关：第一，Upc2p是真菌细胞膜麦角固醇合成的关键调节因子；第二，Upc2p通过调节药物外排泵基因的表达水平来影响菌株对药物的敏感性。

3.2.1 野生型Upc2p上调ERG11基因表达在白色念珠菌临床耐药株的中，ERG11基因过度表达引起药物靶酶Erg11p蛋白增加，是唑类药物敏感性下降的主要原因。ERG11基因表达水平高低与Upc2p活性和ERG11基因突变有关[13]。在氟康唑耐药的白色念珠菌中，ERG11基因产物增多，氟康唑无法阻止全部的酶活性，白色念珠菌继续合成麦角固醇，得到存活。由于Upc2p能够直接激活ERG11基因以及多个参与麦角固醇合成的ERG基因的转录与表达，因此白色念珠菌对唑类药物耐药与Upc2p活性改变密切相关。UPC2基因表达水平变化以及基因突变是Upc2p活性的重要影响因素。在氟康唑耐药的临床白色念珠菌中发现，UPC2基因、ERG11基因以及参与麦角固醇合成的其他基因表达均发生了上调，证实UPC2基因过度表达后激活ERG11基因表达，导致细胞内Erg11p酶增加，引起白色念珠菌对唑类药物耐药。

3.2.2 突变型Upc2p上调ERG11基因表达白色念珠菌UPC2基因发生有义突变后引起ERG11基因表达上调，导致菌株产生耐药性[14]。研究发现，白色念珠菌Upc2p的C末端是重要的功能区，是基因突变的热点地区，UPC2基因易发生G648D或A643T突变[15]，两种突变均会引起真菌对唑类药物耐药。将G648D突变型UPC2基因引入敏感株，突变型Upc2p活性增强，造成突变菌株ERG11基因持续性表达上调，白色念珠菌对氟康唑呈现耐药性。另有研究指出，白色念珠菌临床耐药株的UPC2基因发生了A643V突变。A643V突变型白色念珠菌的氟康唑MIC提高了两倍，麦角固醇含量高于野生型菌株。QRT-PCR表明，突变型菌株的UPC2基因以及ERG2、3、5、6、9、10、11基因的mRNA水平均高于野生型。值得注意的是突变型菌株的ERG1基因的mRNA水平低于野生型。这些结果提示：UPC2基因的点突变，除了自身具有顺式调节作用外，还发挥反式调节作用，调节其他ERG基因的转录[13]。

3.2.3 Upc2p调节药物外排泵基因表达在白色念珠菌临床耐药株中还观察到，TAC1、MRR1等转录因子发生功能性突变后会导致CDR1、MDR1等药物外排泵蛋白过度表达，继而引起菌株产生多重耐药性[16]。这也提醒我们，Upc2p可能也具有类似功能，通过转录调节某些药物外排泵蛋白的表达，而诱导真菌对某些药物产生多重耐药性。另外，在白色念珠菌临床耐药株中还发现，氟康唑类药物的靶标酶的编码基因ERG基因发生点突变，也会引起ERG基因过度表达，从而使菌株产生耐药。临床研究已发现，Erg11p有60多种突变型，其中的Y132H、G450E、G464S、R467K和S405F突变型与氟康唑和伏立康唑的敏感性有关，与泊沙康唑敏感性无关[17]。

综上所述，白色念珠菌UPC2基因编码的Upc2p是一种重要的转录因子，能对ERG基因以及某些药物外排泵蛋白基因表达发挥调节作用，从而诱导白色念珠菌对唑类药物产生耐药性。

[1]刘奇,武有聪,王晓丽,等.HIV相关性口腔白色念珠菌的毒力研究[J].中国病原生物学杂志,2010,5(8):564-566.

[2]黄丽芳,刘洪利.院内感染白色念珠菌危险因素的分析[J].检验医学与临床,2011,8(12):1479-1480.

[3]韦仕喻,黄翠波.某院2008～2010年真菌感染临床分析[J].检验医学与临床,2012,9(18):2353-2354.

[4]Akins RA.An update on antifungal targets and mechanisms of resistance in Candida albicans[J].Med Mycol,2005,43(4):285-318.

[5]卢运照,莫海岸.白色念珠菌的临床耐药性变迁及控制措施研究[J].检验医学与临床,2012,9(23):2945-2946.

[6]Snelders E,Karawajczyk A,Schaftenaar G,et al.Azole resistance profile of amino acid changes in Aspergillus fumigatus CYP51A based on protein homology modeling[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2425-2430.

[7]Lamb DC,Kelly DE,White TC,et al.The R467K amino acid substitution in Candida albicans sterol 14alpha-demethylase causes drug resistance through reduced affinity[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(1):63-67.

[8]Chau AS,Mendrick CA,Sabatelli FJ,et al.Application of real-time quantitative PCR to molecular analysis of Candida albicans strains exhibiting reduced susceptibility to azoles[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(6):2124-2131.

[9]Holmes AR,Keniya MV,Ivnitski-Steele I,et al.The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates[J].AntimicrobAgents Chemother,2012,56(3):1508-1515.

[10]Vandeputte P,Ischer F,Sanglard D,et al.In vivo systematic analysis of Candida albicans Zn2-Cys6 transcription factors mutants for mice organ colonization[J].PLoS One,2011,6(10):e26962.

[11]Johnston DA,Eberle KE,Sturtevant JE,et al.Role for endosomal and vacuolar GTPases in Candida albicans pathogenesis[J].Infect Immun,2009,77(6):2343-2355.

[12]Oliver BG,Song JL,Choiniere JH,et al.cis-Acting elements within the Candida albicans ERG11 promoter mediate the azole response through transcription factor Upc2p[J].Eukaryot Cell,2007,6(12): 2231-2239.

[13]Hoot SJ,Smith AR,Brown RP,et al.An A643V amino acid substitution in Upc2p contributes to azole resistance in well-characterized clinical isolates of Candida albicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(2):940-942.

[14]MacPherson S,Akache B,Weber S,et al.Candida albicans zinc cluster protein Upc2p confers resistance to antifungal drugs and is an activator of ergosterol biosynthetic genes[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(5):1745-1752.

[15]Heilmann CJ,Schneider S,Barker KS,et al.An A643T mutation in the transcription factor Upc2p causes constitutive ERG11 upregulation and increased fluconazole resistance in Candida albicans[J]. AntimicrobAgents Chemother,2010,54(1):353-359.

[16]Lohberger A,Coste AT,Sanglard D.Distinct roles of Candida albicans drug resistance transcription factors TAC1,MRR1,and UPC2 in virulence[J].Eukaryot Cell,2014,13(1):127-142.

[17]Xu Y,Chen L,Li C.Susceptibility of clinical isolates of Candida species to fluconazole and detection of Candida albicans ERG11 mutations[J].JAntimicrob Chemother,2008,61(4):798-804.

R372

A

1003—6350（2014）17—2564—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.1001

2014-03-25)

南京军区医学科技创新项目（编号：12MA050）

张晓云。E-mail：zhangxy167@163.com