李艳丽，王增仙，武敏霞

生理条件下，蛋白磷酸酶2A（PP2A）与蛋白激酶调节微管相关蛋白tau蛋白磷酸化水平，处于低水平磷酸化的动态平衡［1］。冈田酸（okadaic acid，OA）是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，对PP2A有特异性抑制作用［2］。OA能使神经元tau蛋白异常过度磷酸化，继而引起神经元毒性［3］。

Degterev等［4］研究发现，在细胞内不存在凋亡信号时，Fas／TNFR能活化一种非凋亡的死亡途径，称为坏死性凋亡（necroptosis）。同时，他们发现一种小分子物质necrostatin-1（Nec-1）可以特异且有效地抑制坏死性凋亡。本研究旨在探讨Nec-1对OA诱导的神经元损伤是否有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试 剂 DMEM／F-12 和 胎 牛 血 清 （Gibco-BRL）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、calcein-AM（Dojindo）；OA、阿糖胞苷、多聚赖氨酸、Nec-1（Sigma）；胰蛋白酶（Biosharp）；乳酸脱氢酶（LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 原代细胞培养 取新生1 d～3 d Wistar大鼠，分离大脑皮层，用胰酶消化制备单细胞悬液。细胞悬液经1 000 r／min离心5 min，弃上清，用完全培养液（DMEM／F-12培养基＋15%胎牛血清）重悬细胞。然后接种于培养瓶或培养板上，在37℃，5%CO2的孵育箱培养。24 h后加入10μmol／L阿糖胞苷。成熟的神经元（8 d～10 d）用于实验。

1.3 实验分组 将 Wistar大鼠分为5组，对照组、OA组（10 nmol／L）、Nec-1组在加入OA前24 h加入不同浓度的Nec-1（10μmol／L，30μmol／L，100μmol／L）预孵育。

1.4 细胞活力检测 细胞在96孔板培养（100μL／孔），向各孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃，5%CO2的孵育箱孵育2 h，用酶标仪测定490 nm处OD值。

1.5 LDH的检测 当细胞遭受损伤时，LDH由胞浆释放到胞外。加入OA 24 h后，收集培养液检测LDH活性。

1.6 calcein-AM染色 细胞与calcein-AM避光孵育20 min，PBS避光洗涤两次，在490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜下观察细胞。

1.7 统计学处理 计量资料用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Nec-1抑制OA引起的细胞活力的下降 CCK-8细胞活力检测发现OA引起皮层神经元损伤。……