黄莉宁 薛汝增 罗光浦 陈勇军 曲永彬 吴铁强 林尔艺 陈永锋

·短篇论著·

p－Akt、p－FoxO1在寻常型银屑病皮损中的表达

黄莉宁 薛汝增 罗光浦 陈勇军 曲永彬 吴铁强 林尔艺 陈永锋∗

目的: 检测p－Akt和p－FoxO1蛋白在寻常型银屑病皮损中的表达。方法: 收集30例寻常型银屑病患者的皮损及30名健康对照皮肤组织,采用Western blot法检测p－Akt和p－FoxO1的表达。结果: 与正常皮肤组相比,寻常型银屑病皮损中p－Akt和p－FoxO1的表达水平明显上调,两组具有统计学差异(P＜0.05)。结论: Akt和FoxO1可能与银屑病皮损中角质形成细胞的异常增殖有关。

寻常型银屑病； FoxO1； Akt； 蛋白印迹法

寻常型银屑病是一种红斑鳞屑性疾病,其发病率高、难治愈、易复发,严重影响患者的身心健康。目前认为本病是遗传因素与环境因素等多种因素相互作用的多基因遗传病,通过免疫介导的共同信号通路引起角质形成细胞过度增殖。1组织病理具有角质形成细胞过度增殖和真皮乳头血管新生且迂曲扩张等特点。2目前引起角质形成细胞过度增殖的机制尚未阐明。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)/Akt信号转导通路是细胞存活的重要通路,参与细胞生长、细胞增殖等多个过程。FoxO1作为其下游的效应靶蛋白,在细胞生长、细胞增殖中亦发挥重要作用。本研究对寻常型银屑病皮损中Akt及其下游效应靶蛋白FoxO1的磷酸化水平进行检测,探讨其在银屑病发病过程中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集本院2012年门诊和住院的寻常型银屑病患者30例,其中男15例、女15例,年龄16～54岁,平均36.2岁,病史0.5个月至27年,所有病例均具有典型皮损并经组织病理诊断,本次发病以来均未经任何治疗。健康对照组30例,来自我院皮肤外科手术多余的正常皮肤或手术环切的包皮。取材后,将标本立即置于液氮中冷冻保存。本研究经医院伦理委员会通过并与患者签署知情同意书。

1.2 试剂 p－Akt1/2/3(Ser473)、β－actin多克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司,p－FoxO1(S256)多克隆抗体购于美国Abcom公司,AP标记的山羊抗兔多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术公司,10%SDS－PAGE预制胶购于上海生工生物工程公司,聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购于美国PALL公司,BCA法蛋白定量试剂盒、RIPA蛋白裂解液、ECL显色试剂盒、Tris－甘氨酸电泳缓冲液、半干转膜液及其它试剂购于江苏碧云天生物技术公司。

1.3 Western blot检测 从液氮中取出冻存的标本,用眼科剪将组织剪切成细小的碎片并用组织匀浆器匀浆,RIPA细胞裂解液(内含PMSF)冰上裂解细胞, BCA法测定蛋白浓度,取50 μg总蛋白变性后进行SDS－PAGE恒压电泳,半干法将电泳产物转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉4℃封闭2 h,滴加一抗(1∶1000),4℃过夜,TBST洗膜4次,每次10 min,滴加二抗(1∶5000),37℃孵育2 h,TBST洗膜4次,每次10 min,按ECL试剂盒说明进行显色,在自动电泳凝胶成像分析系统下自动成像,分析目的蛋白条带的平均灰度值,以β－actin蛋白作为内参,以目的蛋白与β－actin的灰度比值作为目的蛋白的相对含量,进行统计学分析。

1.4 统计学方法 所有数据以¯x±s表示,采用SPSS 16.0软件进行统计分析,每两组相对灰度值之间的比较采用t检验,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

寻常型银屑病皮损中p－Akt及p－FoxO1的相对灰度值为1.02±0.27和1.83±0.61,与健康对照组0.55 ±0.09和0.69±0.12相比,具有显著统计学差异(t＝5.41,P＜0.05)。结果见图1、2。

图1 两组灰度值电泳图

图2 两组灰度值比较

3 讨论

研究发现,寻常型银屑病皮损组织中角质形成细胞的增生速度是正常表皮的2倍,而其细胞周期缩短了8倍(36 h比311 h),每日生成的角质形成细胞数量高出正常表皮的28倍。3角质形成细胞良性过度增殖是寻常型银屑病的病理特征之一,而对其过度增殖的机制目前仍未完全阐明。李政霄等4发现上皮钙黏素和β连环蛋白表达下调可能与银屑病角质形成细胞高度增殖有关；刘厚君等5发现细胞周期蛋白A、D1、B1和E可能通过诱导细胞增殖参与了银屑病的发病。但这些研究仅局限于下游效应分子的表达,对于上游信号传导的调控未阐明。为此,本研究将PI3K/Akt信号通路及下游FoxO1蛋白作为研究靶点,进一步阐明其可能的发病机制。

PI3K/Akt信号通路是细胞内一条调控细胞增殖的重要通路,Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,属于一种癌基因,因其与蛋白激酶A和C有高度同源性,又被命名为蛋白激酶B(简称PKB)。6Akt是PI3K信号通路关键的分子,通过磷酸化其下游糖原合成酶激酶－3、Bad(Bcl－2家族成员)、FoxO家族等蛋白来调控细胞的增殖与凋亡。7,8本研究发现,银屑病皮损中p－ Akt的表达水平明显上调,这与张晓艳等9的研究结果一致。既往研究银屑病中PI3K/Akt信号下游转导通路局限于Bad及mROT,形成PI3K/Akt/mROT通路,10而对于Fox蛋白家族的表达情况,研究较少。

Fox蛋白(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称,2000年正式统一命名,是一个具有多种功能的转录因子大家族,通常和细胞生长发育的调控有关。11该家族的共同特征是具有一个长110个氨基酸的DNA结合结构域,称为Fox结构域,折叠成3个α螺旋和2个翅膀状(winged)的大环结构。至今已经定义了17类Fox蛋白,即FoxA～Q,目前研究最多的是FoxO亚家族。12FoxO在进化上高度保守,氨基酸序列中含有3个Akt磷酸化基序,是胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路中的关键因子,其上游受PI3K/Akt磷酸化级联通路的调节,下游靶基因则与细胞增殖、分化、代谢、凋亡及基因表达密切相关。13FoxO1作为FoxO家族的重要亚成员之一,主要在脂肪组织高表达,在生长因子或胰岛素刺激下,通过Akt依赖的Thr32、Ser253和Ser315三个特殊位点的磷酸化而受到调控。这种Akt依赖的磷酸化发生后,改变FoxO1蛋白的亚细胞定位,使其从细胞核向胞浆转移,失去转录因子的活性,减少其下游靶基因的合成,从而失去对细胞增殖的抑制,导致细胞的过度增殖。

由此推测,银屑病皮损内的炎症因子激活PI3K,进一步活化Akt,磷酸化的Akt导致下游的FoxO1磷酸化水平升高,使其从细胞核向胞浆转移,失去转录因子的活性,导致下游效应分子的表达异常,使得角质形成细胞出现过度增殖。本研究结果显示寻常型银屑病皮损中Akt、FoxO1的磷酸化水平增高,证实了该推论。

1张学军.皮肤性病学.7版.北京:人民卫生出版社,2008.141－144.

2朱学骏,涂平.皮肤病的组织病理诊断.2版.北京:北京大学医学出版社,2001.65－67.

3郑敏.银屑病发病机制研究中若干问题的思考.中华皮肤科杂志,2006,39(3):121－123.

4李政霄,纪泛扑,彭振辉,等.上皮钙粘素、β－连环蛋白、细胞周期素D1在进行期寻常型银屑病皮损的表达.南方医科大学学报,2008,28(4):545－547.

5刘厚君,吴艳,林能兴,等.寻常型银屑病皮损中细胞周期蛋白A、D1、B1和E的表达.中国麻风皮肤病杂志,2007,23 (2):98－100.

6 Vandermoere F,El YI,Adriaenssens E,et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor－2 is mediated through nuclear factor－kappaB activation induced via interaction between Akt and IkappaB kinase－beta in breast cancer cells.Oncogene, 2005,24(35):5482－5491.

7 Fatrai S,Elghazi L,Balcazar N,et al.Akt induces beta－cell proliferation by regulating cyclin D1,cyclin D2,and p21 levels and cyclin－dependent kinase－4 activity.Diabetes,2006,55 (2):318－325.

8 Parcellier A,Tintignac LA,Zhuravleva E,et al.PKB and the mitochondria:AKTing on apoptosis.Cell Signal,2008,20(1): 21－30.

9张晓艳,周平,尤立平,等.银屑病皮损表皮内Akt的激酶活性增强.中华皮肤科杂志,2009,42(6):413－416.

10 Chen L,Wu J,Pier E,et al.mTORC2－PKBalpha/Akt1 Serine 473 phosphorylation axis is essential for regulation of FOXP3 stability by chemokine CCL3 in psoriasis.J Invest Dermatol,2013,133(2):418－428.

11 Kaestner KH,Knochel W,Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors.Genes Dev, 2000,14(2):142－146.

12 Huang H,Tindall DJ.Dynamic FoxO transcription factors.J Cell Sci,2007,120(Pt 15):2479－2487.

13 Essafi A,Gomes AR,Pomeranz KM,et al.Studying the subcellular localization and DNA－binding activity of FoxO transcription factors,downstream effectors of PI3K/Akt.Methods Mol Biol,2009,462:201－211.

(收稿:2014－04－05 修回:2014－05－27)

The expressions of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris

HUANG Li-ning,XUE Ru-zeng,LUO Guang-pu,et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou,510091

Objective:To detect the expression of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris. Methods:The levels of p－Akt and p－FoxO1 were detected by Western Blot in the lesions from 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin specimens from 30 healthy controls.Results:Compared with the controls,the expressions of p－Akt and p－FoxO1 were significantly up－regulated in psoriasis vulgaris lesions(P＜0.05).Conclusion:p－Akt and p－FoxO1 may contribute to the abnormal proliferation of keratinocytes in the lesions of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FoxO1；Akt；Western blot

广东省皮肤病医院,广东广州,510091

∗通信作者