王艺淳 林新瑜王 芳 廖恒利 刘 伟 陈明懿

芍药苷对人黑素细胞生物活性及迁移的影响

王艺淳 林新瑜∗王 芳 廖恒利 刘 伟 陈明懿

目的: 确定芍药苷对人黑素细胞生物活性及迁移的影响。方法: 体外培养人表皮黑素细胞,分别使用MTT法、L－DOPA法、NaOH法、Transwell小室法检测不同浓度的芍药苷对黑素细胞的增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成以及黑素细胞迁移的影响。结果: 芍药苷能显著促进黑素细胞增殖和上调酪氨酸酶活性,且10 μg/mL是产生这两方面作用的最佳浓度；芍药苷也能促进黑素的合成,50 μg/mL时作用最显著。芍药苷在20 μg/mL时显著促进黑素细胞迁移。各组与空白对照组比较差异均有显著性(P＜0.05)。结论: 芍药苷单体可能是白芍中促进黑素细胞迁移的主要活性成分。

芍药苷； 补骨脂素； 黑素细胞

白芍,毛茛科芍药属植物,高频率出现在许多治疗白癜风和黄褐斑的方剂中,1具有良好的治疗色素障碍性疾病的疗效。芍药苷(paeoniflorin,PF)作为白芍的主要单体,具有抗氧化及改善微循环等作用。2本文选取白芍的单体做实验,相比成分复杂的原药,更能准确反应其对黑素细胞的影响。研究发现,黑素细胞的迁移在白癜风的色素恢复中起重要作用。3本文将芍药苷作用于黑素细胞,观察其迁移情况,并选取补骨脂素作为阳性对照,以期为治疗色素障碍性疾病寻找安全、有效的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料 黑素细胞来源于健康青少年包皮环切术后皮肤组织原代培养而来。芍药苷、补骨脂素均购自成都市药检所；人表皮黑素细胞培养基Medium254型,人黑素细胞生长添加剂－2,胎牛血清,胰酶等购自Gibco公司；左旋多巴(L－DOPA),噻唑蓝(MTT),纤维连接蛋白均购自Sigma公司；分离酶II购自Roche公司；细胞培养瓶,Transwell小室均购自Corning公司；倒置相差显微镜DP72产自Olympus公司；全自动酶标分析仪,CO2恒温孵育箱均产自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞的体外培养及鉴定 黑素细胞的培养和鉴定方法参见文献,4鉴定采用左旋多巴染色和S－100蛋白免疫组化染色,4经鉴定证实为黑素细胞后,取纯化黑素细胞进行试验。

1.2.2 对黑素细胞生物活性的影响测定 将黑素细胞接种于96孔培养板。将芍药苷、补骨脂素分别稀释为2.5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL由低到高6个浓度梯度。分别加入上述96孔板中,每浓度设4个复孔,并设空白对照组(只加细胞和培养基)及无细胞组(只加培养基),以补骨脂素组为阳性对照。

黑素细胞增殖活性的测定:采用MTT法。按上述分组后96孔板继续放入培养箱72 h,取出后每孔分别加入20 μL 1 mg/mL的MTT溶液。再继续37℃培养4 h。每孔再加入二甲基亚砜150 μL,振荡10 min后立即置于酶标仪490 nm波长处测量各孔吸光度值。按以下公式计算:细胞增殖率＝(实验组吸光度值－无细胞组吸光度值)/(空白对照组吸光度值－无细胞组吸光度值)×100%。

黑素细胞内酪氨酸酶活性的测定:采用左旋多巴(L－Dopa)氧化速率法,按上述分组后96孔板继续放入培养箱48 h,PBS液洗涤后每孔加入0.5%Triton－X溶液100 μL,迅速置于－80℃冻存30 min,取出后室温融化。再每孔加入0.1%L－Dopa溶液,于37℃孵育3 h,置于酶标仪在490 nm波长下测量各孔吸光度值。按以下公式计算:酪氨酸酶活性＝(实验组吸光度值－无细胞组吸光度值)/(空白对照组吸光度值－无细胞组吸光度值)×100%。

黑素细胞黑素合成的测定:采用NaOH裂解法,细胞接种和设组同上,药物分别作用细胞48 h后PBS液洗涤,每孔加入1 mol/L NaOH 100 μL,37℃水浴1 h,用酶标仪测定波长460 nm的吸光度值。按以下公式计算:黑素合成率＝(实验组吸光度值－无细胞组吸光度值)/(空白对照组吸光度值－无细胞组吸光度值)×100%。

1.2.3 对黑素细胞迁移的影响测定 Transwell小室由直径8.0 μm微孔的聚碳酸酯膜将细胞培养孔板分为上下两室,先取出聚碳酸酯膜用纤维连接蛋白包被,过夜晾干。次日洗涤后,将小室放入预先每孔加500 μL的培养液的24孔板内,上室中加入纯化黑素细胞100 μL,下室中分别加入药物等。置37℃、5% CO2条件培养14 h后,取出上室,擦去其内面(未迁移至膜下侧)的细胞。将聚碳酸酯膜用4%多聚甲醛固定30 min,苏木精－伊红(H－E)染色。梯度酒精脱水干燥。置显微镜下观察,高倍镜下(×40)随机取6个视野计数穿膜细胞,所有试验重复3次。

图2 左旋多巴染色黑素细胞(×400)

图3 S－100抗体染色黑素细胞(×400)

图1 原代黑素细胞(×200)

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析。

2 结果

2.1 黑素细胞的培养与鉴定 原代黑素细胞大多胞体圆而小,胞浆透明,呈现2个对称的突起；较少数细胞胞体大且呈多角形,其胞浆内可见色素颗粒,有3个或3个以上的树突(图1)。经左旋多巴染色鉴定,镜下可见胞浆及树突被染成灰棕色或棕褐色(图2)。再经S－100免疫细胞化学染色鉴定镜下见细胞胞浆内着色,呈棕黄色或棕褐色(图3)。以上两种鉴定均表明染色结果为阳性,证实为黑素细胞。

2.2 芍药苷对黑素细胞生物活性的影响 芍药苷能促进黑素细胞的增殖,且在较高浓度(100 μg/mL)时对细胞无明显毒性作用。细胞增殖率随芍药苷浓度升高而增强,并于10 μg/mL时上升到最高。5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL浓度组的芍药苷和补骨脂素均具有显著的促细胞增殖能力,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL浓度组的芍药苷显示出上调酪氨酸酶的活性,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。并于10 μg/mL时,促进作用最强。5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL浓度组的补骨脂素亦显示出上调酪氨酸酶的活性的作用,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

芍药苷组在浓度为20 μg/mL、50 μg/mL时显著的促进黑素合成,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。50 μg/mL是芍药苷组的最佳作用浓度。10 μg/mL、20 μg/mL浓度组的补骨脂素显著促进黑素合成,并于20 μg/mL浓度作用强度最佳。见表3。

表1 不同浓度的中药单体组与空白对照组黑素细胞增殖活性的比较

表2 不同浓度的中药单体组与空白对照组酪氨酸酶活性的比较

表3 不同浓度的中药单体组与空白对照组黑素合成的比较

2.3 芍药苷对黑素细胞迁移的影响 本次迁移的实验浓度选择10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3组。测定结果如下(表4,图4～8)。20 μg/mL的芍药苷组具有显著地促进黑素细胞迁移能力,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。补骨脂素组在10 μg/ mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3个浓度均显著地促进黑素细胞迁移,与空白对照组相比有显著性差异(P＜ 0.05)。其中补骨脂素在浓度20 μg/mL时其作用强度最高(表4,图9～11)。

表4 不同中药单体组与空白对照组黑素细胞迁移的比较

图4 无细胞组(HE,×40)

图5 空白对照组(HE,×40)

图6 10 μg/mL芍药苷组(HE,×40)

图7 20 μg/mL芍药苷组(HE,×40)

图8 50 μg/mL芍药苷组(HE,×40)

图9 10 μg/mL补骨脂素(HE,×40)

图10 20 μg/mL补骨脂素(HE,×40)

图11 50 μg/mL补骨脂素(HE,×40)

3 讨论

中药白芍在黄褐斑和白癜风这两种色素代谢相反的病种中均被广泛使用。但这种中药是通过何种机制作用于色素性疾病尚不清楚。目前许多关于白芍对酪氨酸酶活性影响的研究结果截然不同。既往研究显示白芍对酪氨酸酶活性起促进作用；涂彩霞等5研究发现,白芍无明显上调酪氨酸酶活性的作用；雷铁池等6研究发现白芍对酪氨酸酶活性有高浓度抑制和低浓度激活的作用。以上文献显示不同提取方法及不同药物浓度致其实验结果差异较大,中药成分较为复杂,而中药单体的纯度较高,作为实验对象更科学。芍药苷是一种单萜类糖苷化合物,具有抗自由基损伤,抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性,体内实验证明其有降低血液黏度、改善微循环、抗氧化等多种生物学效应,并且毒副作用较小。2本实验选择白芍的主要单体芍药苷进行实验,并选取补骨脂素作为阳性对照,以作比较。

本实验结果显示芍药苷能促进黑素细胞增殖,并在较高浓度时细胞仍生长较好,并能上调酪氨酸酶活性,且作用强度与补骨脂素相似,无统计学差异。既往张美华等7观察48味中药对体外培养鼠黑素瘤细胞黑素形成的影响,发现白芍对黑素合成无明显影响。而本实验发现芍药苷能促进黑素的合成。另有李剑等8研究表明浓度为5～20 μg/mL的芍药苷可促进黑素细胞增殖,浓度为20 μg/mL的芍药苷显示出对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成均有上调的作用。与本实验结果部分相符。补骨脂作为临床治疗白癜风的常用药,其对黑素细胞增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成的促进作用已被许多实验所证实。9,10本实验中作为阳性对照的补骨脂素在促进黑素细胞增殖,上调酪氨酸酶活性,促进黑素合成方面均有显著作用,与既往文献报道相符。本实验得出芍药苷在一定浓度能促进黑素细胞的生物活性,但未检测出抑制黑素细胞生物活性的作用,猜测可能与药物浓度的选择有关,今后可选择多些浓度点,进一步完善实验。

根据临床观察,在白癜风治疗起效初期,多数患者皮损在毛囊周围先形成色素岛,提示毛囊外毛根鞘中的黑素细胞迁移与色素岛的形成密切相关。11Norris等12也指出黑素细胞的移行与黑素合成在白癜风的复色过程中有同样重要的作用。本研究使用Transwell小室检测体外培养的黑素细胞迁移能力。Transwell小室,即迁移小室,是一种特殊的实验装置。用具有通透性的聚碳酸酯膜将培养系统分隔为上室和下室,从而研究下室培养液中成分对上室内细胞生长、运动的影响。Transwell现已广泛用于细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等多方面的研究。13本实验发现, 20 μg/mL的芍药苷组能显著促进黑素细胞迁移。既往马慧群等14研究显示,补骨脂、白芷等可促进黑素细胞迁移和黏附。与本实验结果相符。综合本实验所得结合相关文献,我们认为白芍的主要单体芍药苷能在多方面促进黑素细胞的生物学活性,并且在一定浓度时能促进黑素细胞的迁移,由此推测白芍中影响黑素细胞的主要活性成分是芍药苷单体。以上实验结果为中药单体的提纯提供了实验依据,并为色素性疾病的治疗提供新的思路。

1贾静.中医药治疗白癜风的近况.中医药信息,2003,20(2):16－20.

2郑世存,李晓宇,欧阳兵,等.芍药苷药理作用研究新进展.中国药物警戒,2012,9(2):100－103.

3 Yoshida H,Kunisada T,Grimm T,et al.Review:melanocyte migration and survival controlled by SCF/c－kit cxpression.J Invest Dermatol Symp Proc,2001,6(1):1－5.

4朱坚勇,吕中法.碱性成纤维细胞生长因子和内皮素－1体外协同培养正常人黑素细胞.中国皮肤性病学杂志,2011,25 (7):535－537.

5涂彩霞,刘之力,任凤,等.47种中药对酪氨酸酶活性的影响及酶动力学的研究.中国麻风皮肤病杂志,2006,6(22):456－458.

6雷铁池,朱文元,夏明玉,等.89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用.临床皮肤科杂志,1999,28(3):147－149.

7张美华,朱文元.48味中药对体外培养鼠黑素瘤细胞黑素形成的影响.江西中医药,1999,20(5):44－46.

8李剑,傅雯雯,张勇,等.中药单体芍药甙促进黑素合成的机制研究.中国麻风皮肤病杂志,2009,25(9):657－659.

9牟宽厚,张宪旗,余兵,等.补骨脂对体外黑素细胞黏附和迁移的作用.中国中药杂志,2004,4(29):346－349.

10王鹰,李海东,孙仁美,等.补骨脂对SCF/Kit/MITF信号通路的调控作用.中国皮肤性病学杂志,2011,9(25):657－660.

11 Zheng J,Jin S,Shi R,et al.Confirmation of PSORS psoriasis susceptibility loci in a Chinese population.Arch Dermatol Res, 2003,295(1):14－18.

12 Norris A,Todd C,Graham A,et al.The expression of the ckit receptor by epidermal melanocytes may be reduced in vitiligo.Br J Dermatol,1996,134(2):299－306.

13周云飞,张爱华,刘文虎,等.Transwell模拟生物屏障.北京生物医学工程,2009,6(28):657－660.

14马慧群,张宪旗,牟宽厚,等.单味中药对黑素细胞黏附和迁移的影响.中国皮肤性病学杂志,2004,18(9):526－527.

(收稿:2014－03－26 修回:2014－06－03)

Effects of paeoniflorin on biological activity and migration of human melanocytes

WANG Yi-chun,LIN Xin-yu,WANG Fang,et al.Department of Dermatology,Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu,610072

Objective:To determine the effects of paeoniflorin on biological activities and migration of melanocytes.Methods:A melanocytes culture system was established and proliferation activity,tyrosinase activity,melanogenesis and migration were detected by MTT,L－DOPA,NaOH method and transwell assay respectively.Results:The paeoniflorin improved the melanocytes proliferation and tyrosinase activity,in which the effects were the most obvious at the concentration of 10 μg/mL.The paeoniflorin promoted the synthesis of melanin,which was the most obvious at the concentration of 50 μg/mL.Paeoniflorin promoted the migration of melanocytes obviously at the concentration of 20 μg/mL.There were significant differences between the paeoniflorin groups and the control groups(P＜0.05).Conclusion:The paeoniflorin is the principal active component of radix paeoniae alba that promoting the migration of melanocytes.

paeoniflorin；psoralen；melanocytes

四川省卫生厅资助课题(编号:110219)

四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所,四川成都,610072

∗通信作者