卢 豪,庞 伟,徐 婷,杨红澎,奚用勇,黄承钰,蒋与刚

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是脑内含量最为丰富的蛋白之一,约占脑内可溶性蛋白的2%。它作为一种去泛素化酶,参与泛素的再循环,调节泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的蛋白降解功能[1-2]。它最初是作为一种神经元特异性蛋白被发现的,被命名为蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)。UCH-L1的作用主要表现在三个方面：(1)泛素水解酶活性:单体形式下,UCH-L1催化泛素C末端酯基和氨基的水解,通过这种途径,UCH -L1能循环使用泛素分子,这对于细胞中蛋白的降解至关重要[3]。(2)泛素连接酶活性:二聚体形式下,UCH-L1的连接酶活性以α泛素核蛋白作为底物,以赖氨酸63为连接点形成泛素链,这使得底物免受蛋白酶体系统的降解,从而维持底物的稳定性[4]。(3)单体稳定效应:大量泛素单体与UCH-L1紧密连接,可阻止泛素单体在脑中的降解[5]。 在前期研究中,我们通过蛋白质组学技术发现缺锌可引起大鼠海马UCH-L1表达下调、电压门控阴离子通道-1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)表达上调,并通过原代海马神经细胞培养实验得到验证[6-7]。因此推测,缺锌引起的学习记忆能力损伤可能与UCH-L1水平降低[8]、VDAC1水平上升相关联。为了深入研究UCH-L1在缺锌致认知功能损伤中的作用机制,我们首先选用pEGFP-N1质粒构建UCH-L1基因重组表达载体,取得阳性克隆,命名为pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒并进行鉴定,为进一步通过细胞转染实验探讨UCH-L1在神经退行性疾病机制中的作用奠定基础,同时也为VDAC1的深入研究进行技术储备。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：新生第1～3 d的Wistar乳鼠,由天津医科大学实验动物中心提供[许可证号：SYXK(津)2009-0001]。Trizol 试剂、琼脂糖购自Invitrogen 公司；TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)、DNA Ligation Kit Ver.2.0、DNA Ligation Kit、BglⅡ限制酶和SalⅠ限制酶均购自大连TaKaRa公司；DH5α感受态细胞、TIANgel Midi Purification Kit购自北京天根公司；EZgeneTMEndoFree ezFlow Plasmid Miniprep Kit购自美国Biomiga公司；pEGFP-N1质粒由军事医学科学院卫生学环境医学研究所全军军事应激医学重点实验室刘晓华教授馈赠。

1.2引物设计 根据UCH-L1基因(GenBank NM_017237)信息添加酶切位点(BglⅡ,SalⅠ),设计扩增引物,上游引物序列：5' GCCAGATCTATGCAGCTGAAACCGATGG 3'；下游引物序列：5' ACGCGTCGACGCGGCTGCTTTGCAGAGAGC 3'。引物由大连宝生物公司合成。

1.3UCH-L1基因的扩增 用Trizol试剂提取Wistar乳鼠脑组织总RNA,逆转录PCR扩增UCH-L1基因。反应体系为：10×one step RNA PCR Buffer 5 μl,MgCl2(25 mM) 10 μl,dNTP混合物(各10 mM)5 μl,RNase抑制剂(40 U/μl)1 μl,AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl,AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl,上游引物(20 μM)1 μl,下游引物(20 μM)1 μl,上样量1 μl,补足RNase Free dH2O至50 μl。反应条件为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环；72 ℃ 7 min。

1.4pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建 回收纯化基因扩增产物,与pEGFP-N1载体分别经Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ酶切,再回收纯化UCH-L1基因及pEGFP-N1载体片段,经T载体16 ℃反应30 min,连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布于含50 μg/ml卡那霉素的LB平板,于37 ℃培养 12～16 h,挑取单一的菌落扩增培养。提取质粒由北京华大基因公司测序。

2 结果

2.1UCH-L1基因的扩增结果 提取的RNA通过RT-PCR反应及琼脂糖电泳分离,如图1所示获得了预期的约700 bp片段,并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 DNA片段。

图1 RT-PCR扩增UCH-L1基因

2.2质粒和目的DNA 基因片段的双酶切结果 将目的DNA基因片段和pEGFP-N1质粒同时进行双酶切,电泳结果见图2。从凝胶回收目的片段,然后进行连接反应,转化DH5α感受态细胞,铺板,于37 ℃培养12～16 h,挑取单一的菌落扩增培养,提取质粒进行测序分析。

图2 pEGFP-N1质粒和UCH-L1基因片段双酶切产物的琼脂糖电泳图

2.3质粒测序鉴定结果 图3为质粒测序结果,通过Blast搜索,证明就是我们所克隆的UCH-L1基因。结果表明,已成功构建了pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒。

图3 pEGFP-N1-UCH-L1质粒序列图

3 讨论

UCH-L1属于泛素蛋白酶体系统中的泛素羧基端水解酶家族,分布于脑、睾丸、卵巢、肾脏、肿瘤等组织,经由泛素相关途径行使对细胞分化、增生和凋亡的调节功能。UCH-L1在大脑中的表达要远远高于睾丸、卵巢、肾脏等组织,与脑功能密切相关。UCH-L1在神经元内广泛表达,已观察到海马神经元胞体和树突内均有分布,以维持海马神经元的正常突触结构和功能[9-10]。而且研究发现,UCH-L1对于维持正常的突触功能和学习记忆能力是必需的,恢复UCH-L1水平,可逆转β淀粉样蛋白处理的海马脑片和阿尔茨海默病模型小鼠海马脑片的突触传递功能障碍,并且给予外源性UCH-L1可改善模型小鼠的认知功能[11-12]。在胚胎的发育中,UCH-L1已经分布于未分化的中枢神经和周围神经。研究表明,UCH-L1通过与单体泛素的相互作用,来调控神经元前体细胞的形态和分化,从而证明了UCH-L1在神经系统中的重要地位[13]。在成熟神经元中,UCH-L1仍然有很高的表达。

作为UPS中一种重要的酶,UCH-L1在阿尔茨海默病、帕金森症等神经退行性疾病发生及发展中的重要作用日益受到关注,但众多的环节与机制尚不清楚,有待于开展更深、更细致的研究。而pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的成功构建,为转染原代培养海马神经细胞,促进UCH-L1的表达,进一步研究该基因在缺锌致认知功能损伤中的作用机制提供了有力载体。

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