马 妍，谢 晶，周 然，刘 源

(上海海洋大学 食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306)

河豚鱼又名鲀鱼，属于硬骨鱼纲鲀形目鲀科，是暖水性海洋底栖鱼类，广泛分布于北太平洋西部，在我国各大海域都有捕获。河豚鱼肉质鲜美，含有丰富的不饱和脂肪酸，营养价值极高，与鲥鱼、刀鱼并称为“长江三鲜”。在我国，河豚鱼有30余种，常见的有黄鳍东方鲀、虫纹东方鲀、红鳍东方鲀、暗纹东方鲀等，随着河豚鱼养殖技术的发展，暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)以生长较快且肌肉无毒的特点而在长江流域的渔场里得到较快的发展[1]。

近年来，单一的活鱼销售已经不能满足河豚鱼产量日益增长的需求，冻藏是鱼类贮藏的主要方式之一，但是冷冻贮藏可能对鱼肉的品质产生较大的影响，而目前对于河豚鱼的冻藏研究较少。本试验对河豚鱼冻藏过程中鱼肉生化指标以及鱼肉质构和肌肉微观结构的变化进行了研究，旨在为河豚鱼的冷冻加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

暗纹东方鲀，由上海能正渔业科技开发有限公司提供。主要仪器有Sartorins PB-10精密数显酸度计、Kjeltec2300凯氏定氮仪、TDL-5-型低速离心机、Unico 2100分光光度计、TA-XT2i质构分析仪、JEM2100透射电子显微镜。

1.2 样品处理

将新鲜的暗纹东方鲀去头及内脏，用冰水洗净，沥干，分块，分5组装袋，分别置于-(10±1) ℃、-(18±1) ℃、-(25±1) ℃、-(30±1) ℃和 -(86±1) ℃ 低温冰箱中冷冻保藏，每隔30 d取样1次，进行理化指标测定。

1.3 测定指标与方法

将冷冻的河豚鱼块置于4 ℃冰箱中解冻12 h，取解冻后样品用于各理化指标的测定。

1.3.1 pH值 将样品鱼肉剁碎后，取5 g于烧杯中，加入45 mL中性蒸馏水，搅拌均匀，静置30 min，然后用精密数显酸度计测定pH值[2]。

1.3.2 硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)值 参照Salih等[3]的方法并加以改进。准确称取河豚鱼肉5 g，切碎置烧杯中，加入15 mL体积分数20%三氯乙酸溶液(TCA)和10 mL蒸馏水，匀浆60 s，静置1 h后过滤，滤液用蒸馏水定容至50 mL，取5 mL滤液备用，加入5 mL硫代巴比妥酸溶液(TBA，0.02 mol/L)，沸水浴中反应20 min，取出，流动水冷却5 min后用分光光度计在532 nm处测吸光度A532，重复3次。取25 mL体积分数 20%TCA用蒸馏水定容到50 mL，静置过滤后取5 mL滤液加5 mL硫代巴比妥酸溶液，采用上述方法进行测定，作为分光光度计的空白对照。按下式计算TBA值：TBA=A532×7.8 mg/hg。

1.3.3 挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)含量 利用半微量凯氏定氮的原理，准确称取绞碎的河豚鱼鱼肉5 g于350 mL消化管中，设置吸收液量为30 mL，自动加蒸馏水量为30 mL，加碱量为0 mL，模式为delay，在装有样品的消化管瓶中加入5 g氧化镁粉末，迅速放入凯氏定氮仪进行测定[4]。

1.3.4 质构分析 采用TA-XT2i质构分析仪对样品进行质构分析。分析探头为直径6 mm的P-6柱形探头，利用TPA模式，测试速率为1 mm/s，压缩程度为30%，每种处理重复测试6次。本试验采用的质构参数硬度定义为第一次压缩时的最大峰值[5]。

1.3.5 肌肉微观结构观察 参照Taylor等[6]的方法，将鱼肉切成长×宽×高为2 mm×3 mm×10 mm大小的薄片，经磷酸缓冲液漂洗后，加入体积分数 2.5% 的戊二醛溶液，置于4 ℃条件下预固定2 h；将样品取出，用磷酸缓冲液漂洗1 h，放入体积分数1%的锷酸溶液中再次固定1 h；取出样品后分别用体积分数30%，50%，70%，80%，90%和100%的乙醇进行脱水，脱水后用Epon812环氧树脂对样品进行包埋，然后制成超薄切片，采用醋酸铀和柠檬酸铅双染色法进行染色，最后使用JEM2100透射电子显微镜对鱼肉的微观结构进行观察。

1.3.6 盐溶性蛋白含量 取鱼肉5 g加0.6 mol/L氯化钾30 mL，于4 ℃离心(3 000 r/min) 10 min，取上清液采用双缩脲法[7]测定蛋白含量。

1.3.7 巯基含量 参照Benjakul等[8]的方法，取1 mL的肌动球蛋白 (质量分数0.4%)，加入9 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液，混匀后取4 mL混合溶液，加入0.4 mL质量分数1% 的DTNB，于40 ℃培养25 min后，用分光光度计在412 nm处测吸光度A412， 空白对照以pH 7.0的0.6 mol/L KCl代替样品。根据测定的A412值，结合标准曲线计算巯基蛋白含量。

1.4 数据统计

采用SPSS17.0软件的Duncan法对试验数据进行多重比较和方差分析，P<0.05表示差异显著。利用Origin Pro 8.0绘制曲线。

2 结果与讨论

2.1 冻藏过程中河豚鱼鱼肉pH值的变化

在鱼肉冻藏过程中，随着冻藏时间的延长，鱼肉中的蛋白质在一些酶的作用下逐渐分解产生氨基酸及其他碱性物质，同时细菌利用氨基酸及其他含氮小分子产生氨及胺类，导致pH值上升。由图1可以看出，河豚鱼鱼肉的pH值随着冻藏时间的延长逐渐上升，并且冻藏温度越高，pH值上升幅度愈大，-86 ℃时鱼肉的pH值上升最慢。由此可知，冻藏温度越高，鱼肉pH值相应越高，较低的冻藏温度可有效延缓鱼肉蛋白的分解，减缓pH值的上升。

图1 冻藏过程中河豚鱼鱼肉pH值的变化

2.2 冻藏过程中河豚鱼鱼肉TBA值的变化

河豚鱼鱼肉中含有丰富的不饱和脂肪酸，极易氧化。而且冻结使鱼肉的自由水含量减少，增加了剩余溶液的浓度，使氧化速率加快[9]。在冻藏过程中，河豚鱼肉TBA含量的变化动态如图2所示。由图2可知，冻藏时间越长，冻藏温度越高，鱼肉TBA含量越高，差异越明显(P<0.05)。在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下冻藏180 d后，TBA含量由最初的 0.030 3 mg/hg分别上升至1.014 1，0.760 5，0.522 6，0.382 2 和0.230 1 mg/hg，说明较低温度的冻藏有利于减缓脂肪的氧化。Aubourg等[10]研究指出，鳕和黑线鳕在-10，-30 ℃冻藏12周后，TBA含量分别上升345.5%，136.4%和 61.5%，19.2%，与本试验结论相类似。

2.3 冻藏过程中河豚鱼鱼肉TVB-N含量的变化

TVB-N是鱼肉蛋白质腐败过程中，因酶和细菌的分解作用产生的氨和胺类等碱性含氨物质。TVB-N含量是鱼类等动物性食品鲜度的重要衡量指标。冻藏过程中河豚鱼鱼肉TVB-N含量的变化如图3所示。

图3 冻藏过程中河豚鱼鱼肉TVB-N含量的变化

图3显示，新鲜河豚鱼鱼肉的TVB-N含量为 9.04 mg/hg；在冻藏过程中，随着冻藏时间的延长，TVB-N含量逐渐上升，且冻藏温度越高，TVB-N值上升越快，-10，-18，-25,-30和-86 ℃条件下冻藏结束时，河豚鱼鱼肉TVB-N的含量分别达到 20.83，17.71，16.59，15.64和14.54 mg/hg，分别较新鲜河豚鱼鱼肉上升了130.42%，95.91%，83.52%，73.01%和60.84%。说明低温冻藏可减慢河豚鱼鱼肉TVB-N的变化。

2.4 冻藏过程中河豚鱼鱼肉质构的变化

随着冷冻贮藏期的延长，鱼肉的质构会发生一些不可逆的不良反应，从而影响鱼类的食用价值，所以研究鱼类冷冻贮藏期间的质构变化显得尤为重要。传统的方法一般采用感官评价来反映食品质构的变化，如食用口感等指标，然而这种评价易受其他因素的影响，如经验、个人嗜好、环境等，并且重现性低。因此，借助质构仪对影响消费者口感的主要因素及食品的一些物理特性进行分析更具实际意义[9]。鱼肉的质构特性变化通过TPA (Texture profile analysis)来反映，采用由仪器分析得到的TPA可以避免感官评价时因分析人员不同而造成的主观误差[11]。由图4可知，随着冻藏时间的延长，河豚鱼鱼肉的硬度呈降低趋势，且冻藏温度愈低硬度变化愈明显，在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下冻藏180 d后，河豚鱼鱼肉的硬度分别降低了26.82%，35.38%，41.14%，45.59%和52.61%。

2.5 冻藏过程中河豚鱼鱼肉微观结构的变化

由图5-a可以看出，新鲜鱼肉肌纤维连接紧密，呈现出良好的肌肉结构形态，因而质地较好。通过比对可知，冷藏期间，鱼肌肉纤维均有不同程度的分离，由于肌肉细胞骨架与肌节和肌内膜发生了分离而呈现撕裂状态(图5-b-f)，但在不同冷藏温度下表现并不相同：-10 ℃条件下，鱼肉的肌肉纤维稍有分离；-18 ℃下，鱼肉的肌肉纤维密度略低于 -10 ℃；-25 ℃下的鱼肉肌纤维较前两者更疏，肌肉纤维之间有明显的空隙；-30 ℃下的鱼肉肌纤维和-25 ℃下差别不大；而在-86 ℃条件下，肌肉纤维已经大部分分离，纤维之间出现大量空隙，甚至出现纤维断裂。由此可知，温度越低，河豚鱼鱼肉的肌肉纤维分离得越明显，这可能是由于低温冻结时鱼肉中的水分形成大量的冰晶，破坏了鱼肉的纤维结构所致。

图5 冻藏条件下河豚鱼鱼肉微观结构的变化

通过比较鱼肉硬度的变化，发现在鱼肉硬度下降的同时，鱼肉的肌肉纤维也在发生着分离与断裂。由此可知，鱼肉肌纤维之间的连接程度与鱼肉硬度的变化有密切关系，肌肉纤维之间连接得越紧密，鱼肉硬度越大[12]。

2.6 冻藏过程中河豚鱼鱼肉盐溶性蛋白含量的变化

蛋白质的盐溶性是反映鱼肉蛋白变性的一个常用指标，在冻藏过程中，氢键、疏水性和二硫键等的形成往往导致蛋白质的盐溶性下降，而且下降程度与冻藏温度相关。盐溶性蛋白含量下降意味着肌肉中的蛋白质发生了冷冻变性，蛋白含量下降越多，表明其变性程度越严重。引起冻藏过程中鱼肉蛋白质变性的因素很多，包括冻藏条件、脂肪含量、二硫键及其相互作用等[13]。也有人认为，鱼肉蛋白中的结合水在冻藏过程中形成冰晶并析出是导致鱼肉蛋白质变性的原因之一[14]。

由表1可知，在冻藏过程中，贮藏时间愈长，温度愈高，河豚鱼鱼肉中的盐溶性蛋白含量下降愈明显。在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下冻藏180 d后，河豚鱼鱼肉中的盐溶性蛋白含量由最初的 44.06 mg/g分别下降为5.77，9.33，11.87，14.69和 17.31 mg/g，分别降低了86.90%，78.82%，73.06%，66.66%和60.71%。

表1 冻藏对河豚鱼鱼肉盐溶性蛋白含量的影响

2.7 冻藏过程中河豚鱼鱼肉巯基含量的变化

低温冻藏过程中河豚鱼鱼肉巯基含量的变化动态如图6所示。

图6 冻藏条件下河豚鱼鱼肉巯基含量的变化

根据图6可知，河豚鱼鱼肉中的巯基含量随着冻藏时间的延长而逐渐下降；贮藏温度越高，巯基含量降低得愈快，在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下冻藏180 d后，鱼肉中的巯基含量分别由最初的0.535 μmol/g降到0.057，0.088，0.115，0.146和0.239 μmol/g，平均下降速率为2.66×10-3，2.48×10-3，2.33×10-3，2.16×10-3和1.64×10-3μmol/(g·d)。说明低温冻藏有助于减缓鱼肉中巯基的减少。Jiang等[15]在研究不同温度下冻藏鳕鱼巯基含量变化时也得出了相似的结论。巯基含量的下降可能是因为冰晶的形成使肌原纤维蛋白的空间结构发生了改变，进而使埋藏在分子内部的巯基活性基团暴露出来而被氧化成二硫键，从而导致巯基含量减少[16]。

3 结 论

冻藏温度不同，贮藏过程中河豚鱼鱼肉各种品质指标的变化不同，并且随着贮藏时间的延长差异会更加明显。冻藏温度愈低，河豚鱼鱼肉的pH、TBA值及TVB-N、盐溶性蛋白和巯基含量的变化愈小。

采用TPA模式对河豚鱼鱼肉的硬度进行测定，结果表明随着冻藏时间的延长，鱼肉的硬度缓慢下降；冻藏温度越低，鱼肉硬度的变化趋势越明显。

通过透射电子显微镜对鱼肉的微观结构进行观察，发现鱼肉肌肉纤维的疏松程度与鱼肉的硬度相关联，肌肉纤维连接得越紧密，鱼肉的硬度越大。

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