李旭艳+恽冬泽+邵淑丽

摘要：以单菌落为模板进行PCR扩增，直接筛选插有发夹RNA（Small hairpin RNA，shRNA）干扰片段的重组阳性克隆。以圆滑单菌落为PCR模板，采用载体通用引物直接扩增目的片段，质粒测序验证 PCR结果的正确性。结果表明，在筛选的6个菌落中均扩增出324 bp的目的条带，进一步进行测序分析鉴定，证实了菌落PCR阳性克隆含有发夹RNA干扰片段。单菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效筛选重组阳性克隆的方法。

关键词：单菌落PCR；重组克隆；发夹RNA

中图分类号：Q781；S961.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0220-02

Application of Individual Bacterial Colonies PCR in Screening

shRNA Recombinant Clone

LI Xu-yan，YUN Dong-ze，SHAO Shu-li

（College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： The individual bacterial colonies were adopted for templates of PCR to screen recombinant clone carrying small hairpin RNA. The PCR amplification with individual bacterial colonies and universal primer was developed to detect targeting fragment. The positive colonies were further confirmed by sequencing. Results showed that among the six clones， the positive band in the size of 324 bp were detected on agarose gel. DNA sequencing confirmed that shRNA template was cloned into plasmid vector successfully. Individual bacterial colony PCR is a simple，rapid，reliable and efficient method for screening the recombinant clones.

Key words： individual bacterial colonies PCR；recombinant clone；shRNA

收稿日期：2013-05-10

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C200624）；黑龙江省教育厅科学技术项目（11511447；12511611）

作者简介：李旭艳（1982-），女，山东济南人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）0452-2782835（电子信箱）lxy0702@126.com；

通讯作者，邵淑丽，教授，主要从事分子生物学方面的研究，（电话）0452-2738219（电子信箱）shshl132@163.com。

在基因重组试验中，筛选含有插入目的基因片段的重组阳性克隆常用的方法有快提质粒、酶切法、互补插入失活法及杂交筛选法等[1]，这些方法各有其优缺点。

近年来，由于聚合酶链反应技术（Polymerase chain reaction，PCR）具有简便、快速及灵敏等特点，研究者建立了PCR鉴定阳性克隆的方法，通常以提取的质粒或者裂解的菌液作为PCR的模板[2，3]，可以获得良好的筛选效率。为进一步简化制备模板的步骤，节约时间，本试验以单个转化菌体为模板，不经过任何处理，采用载体通用引物直接扩增目的片段，来初步鉴定和筛选阳性转化菌，为该方法的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

T4 DNA ligase、BamHⅠ、HindⅢ购自TOYOBO公司，E. coli DH5α、氨苄青霉素（Amp）、PCR试剂盒、pSilencer 3.1-h1 neo（AmpR）载体由鼎国生物技术有限公司提供。……