刘达，张译，谢庆云，廖冬发，陈俊，郑媛，权毅，张波

(1.成都军区总医院骨科，四川 成都 610083；2.成都军区总医院附属口腔医院，四川 成都 610083；3.解放军第37医院，四川 雅安 625000)

2008年发布的《骨质疏松症防治中国白皮书》指出，我国50 岁以上的人群中骨质疏松的总患病率为15.7%，而70%～80%的中老年骨折是因骨质疏松引起的，髋部骨折是最常见的骨折部位之一，每年新发髋部骨折病例为23万。针对骨质疏松性髋部骨折的治疗主要包括预防性药物治疗和骨折后的内固定手术治疗[1，2]。而这些治疗都需要以骨质疏松动物模型为基础来进行研究，其中包括评价药物对髋部骨密度及力学强度的作用和评价内固定植入物在局部的生物力学强度等相关研究。因此，采用合适的髋部骨质疏松动物模型是进行该领域研究的必要前提条件。

研究表明，绵羊髋部的解剖结构和力学分布与人体接近，且卵巢切除术(ovariectomy，OVX)后的绵羊可模拟妇女绝经后因雌激素水平下降而引起的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨小梁结构的变化[3，4]。因此，越来越多的学者选用绵羊来建立骨质疏松大动物模型。目前的研究多集中在采用卵巢切除联合应用激素的方法来建立绵羊骨质疏松模型，但大部分的研究集中在对绵羊腰椎BMD及微观结构的变化进行了评价[5-7]，缺乏对绵羊髋部、尤其是股骨近端BMD及骨组织微观结构的变化的相关研究。因此，本实验采用去势手术联合应用激素的综合处理方法来建立髋部骨质疏松动物模型，通过双能X线吸收骨密度仪测量、micro-CT分析和组织学观察评价该建模方法对绵羊股骨近端的BMD及微观结构的影响作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物 10只健康成年雌性绵羊，年龄(4.5±0.5) 岁，体重(55.0±6.4) kg，均已过生育哺乳期，由成都军区总医院实验动物中心提供。

1.2 实验器材 手术室及术中所需器械均由成都军区总医院实验中心提供。双能X线吸收骨密度仪(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都军区总医院门诊部提供。eXplore Locus SP型Micro-CT (Healthcare，GE，USA)，轮转式硬组织切片机(Leica-LA 2 500，Germany)，全自动显微镜(Leica-LA，Germany)，均由西京医院全军骨科研究所提供。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组、BMD的测量及手术 将所有绵羊随机分为实验组(n=5)和假手术组(n=5)。肌注速眠新Ⅱ(解放军兽医大学军事兽医研究所生产)(0.1 mL/kg)麻醉成功后，将绵羊侧卧于双能X线吸收骨密度仪的扫描台上，采用手动分析模式测定股骨近端感兴趣区域(ROI)的BMD(见图1)，从股骨头下、沿股骨颈方向取矩形的ROI，其宽度接近股骨颈的宽度，长度为从股骨头下到股骨外侧皮质。测量BMD之后将绵羊仰卧于手术台上，术区常规消毒铺单后，切开皮肤及皮下组织，假手术组仅显露双侧卵巢，实验组行双侧卵巢切除术。术后1月开始肌肉注射甲基强的松龙(0.45 mg/kg/d)，每月定期测量一次绵羊体重，根据体重调整注射剂量。连续注射10个月，最后1个月内逐渐减量至停止。停药后观察1个月再次使用相同方法测量双侧股骨近端的BMD。注射激素期间，所有绵羊常规饲养。观察伤口愈合情况、注射部位感染情况及注射期间和停药后有无不良反应。

图1 股骨近端感兴趣区域的BMD测量

1.3.2 椎体标本的制备 去势手术后1年，处死所有绵羊。取出双侧股骨，剔除所有的肌肉及韧带。台钳夹持固定股骨，于股骨头下垂直于股骨颈的轴向将股骨头锯断，用内径为15 mm的自制环钻于股骨颈断面中央、顺股骨颈的轴向方向钻取标本直至钻透股骨近端外侧皮质，保持低速转动并用生理盐水保持标本湿润，尽可能减少因发热而导致组织变性(见图2)。将标本制成上下面平行、高度为30 mm、直径为15 mm的圆柱状股骨近端松质骨标本。所有标本用盐水纱布包裹，密封于塑料袋中存储于-20℃的条件下。实验前所有标本均在室温下自然解冻。

1.3.3 椎体标本的micro-CT分析 在44 mm_tube_21μm_270 min_ss的条件下对标本进行micro-CT扫描和重建。设定重建阈值为1 000，采用Advanced Bone Analysis软件(GE Healthcare，USA)进行骨组织计量学分析。软件自动生成的主要空间参数包括：a)骨体积分数(bone volume fraction，BVF)，即骨小梁的体积除以选中区域的总体积，以%表示；b)骨表面积体积比(bone surface/bone volume，BS/BV)，即骨小梁的表面积除以骨的体积，以mm-1表示。c)骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)以μm表示；d)骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)，以mm-1表示；e)骨小梁间隙(trabecular spacing，Tb.Sp)，以μm表示。

图2 股骨近端骨组织的钻取

1.3.4 椎体标本的组织学观察 将标本用10%中性福尔马林固定5 d，不脱钙。依次经70%、80%、90%、99%、100%的乙醇进行脱水(各18 h)。然后依次浸泡塑料液，包埋后固化成块。使用轮转式硬组织切片机，垂直于标本的长轴方向将骨组织切成厚度约30～50μm的切片。对切片进行丽春红三色染色，使用全自动显微镜观察标本的骨质情况。

2 结 果

2.1 大体观察 术后所有绵羊活动和进食情况正常，未发生手术并发症。术后所有切口均无红肿渗出，10 d后均甲级愈合。注射部位的皮肤均无感染迹象，注射期间和停药后所有绵羊均未见异常反应。

表1 两组绵羊股骨近端BMD测量结果

2.2 绵羊股骨近端BMD 如表1所示，手术前两组股骨近端平均BMD之间的差异无统计学意义(P=0.883)。假手术组手术前后的平均BMD无显著变化(P=0.103)。实验组术后的平均BMD较术前显著下降，差异具有统计学意义(P=0.000)，下降平均为31.7%。且术后实验组的平均BMD显著低于假手术组，差异具有统计学意义(P=0.013)。

2.3 micro-CT分析 通过micro-CT三维重建发现，假手术组中骨小梁数量较多，骨小梁之间连接较密集，具有较好的空间结构；而实验组中的骨小梁数量明显少于假手术组，骨小梁之间排列稀疏，局部多见骨小梁连接中断，空间结构明显差于假手术组(见图3)。对骨组织进行骨计量学分析，实验组的BVF、Tb.Th和Tb.N显著低于假手术组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；BS/BV和Tb.Sp显著高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

图3 两组绵羊股骨近端标本micro-CT三维重建

2.4 椎体的组织学观察 对骨组织切片进行丽春红三色染色后发现(见图4)，假手术组中骨小梁数量多，排列密集，连续性好，骨小梁相互之间连接形成典型的髓腔结构。与假手术组相比，实验组中骨小梁的数量明显减少，排列更为稀疏，可见多处的骨小梁断裂，小梁之间的连续性差，典型的髓腔结构较少见。

表2 两组绵羊股骨近端标本空间参数的比较

a 假手术组16倍镜下组织学观察 b 实验组16倍镜下组织学观察 c 假手术组50倍镜下组织学观察 d 实验组50倍镜下组织学观察

3 讨 论

我国是一个人口老龄大国，骨质疏松性骨折的发病率日益增加。屈波等[8]对成都地区2 457 例老年人骨质疏松性骨折发病特点进行分析，发现髋部骨折所占比例最高为37%。郝永强等[9]对上海地区5 923 例骨质疏松性骨折的发病特点研究分析显示：髋部骨折占22%，脊柱骨折占8%。而髋部骨折骨坏死率及不愈合率高，约20%～40%可造成股骨头缺血性坏死，50%患者可导致畸形，从而影响下肢功能，甚至因为卧床容易发生坠积性肺炎、泌尿系感染、褥疮、下肢静脉血栓形成等并发症，病死率高，社会经济负担重。因此如何积极、有效的预防和治疗髋部骨折已经成为临床医生面临的一个难题。而相关的药物治疗及股骨近端骨折内固定的研究必须以骨质疏松动物模型为基础来进行，因此良好的髋部骨质疏松动物模型是上述研究的前提条件。

目前，学者们进行了多种骨质疏松动物模型的研究。小鼠和大鼠等啮齿类动物缺乏Haversian系统，且体积过小，不适合进行骨组织结构及力学特性的研究。犬类动物与人类的生理周期差别较大，且月经期没有性激素的波动，卵巢及子宫切除后并不能诱导明显的骨量丢失[10]。灵长类动物在生理周期和骨骼结构上与人类接近，很适合作为骨质疏松的动物模型。然而，它们饲养管理要求高，实验操作危险大，费用昂贵；再加上医学伦理道德的原因，该模型的获取和使用均受到很大的限制，因此也不适合建立骨质疏松动物模型。近年来，使用绵羊建立骨质疏松动物模型得到了很多学者的青睐。研究表明：绵羊性情温顺，易于管理和饲养；价格较便宜，可大量购买；自发性排卵，激素分泌与女性类似；年老的绵羊(7～9 岁)可见哈佛系统的重建；且成年绵羊髋部解剖结构及力学分布与人体接近[3，4]。因此，绵羊是适合进行髋部骨质疏松动物模型的建立及内固定稳定性的相关研究。

Augat等[5]发现，OVX联合糖皮质激素注射6个月后，松质骨的BMD和骨小梁体积分别降低了27%和34%；12个月后两者分别降低了33%和37%。而仅行OVX处理对上述指标均无明显降低作用。Schorlemmer等[6]对行OVX后的绵羊持续注射甲强龙(0.45 mg/kg·d)6个月后发现，该方法使皮质骨和松质骨的生成显著减少，皮质骨的厚度显著降低；1年后松质骨的生成和松质骨的BMD分别下降了38%和34%。Lill等[7]通过比较多种建模方法后发现：6个月后，OVX联合甲强龙组中桡骨远端皮质骨和松质骨的BMD分别降低了12.9%～20.3%和29.6%～32.4%；而OVX联合低钙饮食组中皮质骨和松质骨的BMD仅降低了3.9%～5.5%和7.1%～7.4%。目前的研究对髋部周围、尤其是股骨近端骨质条件及微观结构的评价甚少。

因此，针对这些不足，本研究采用目前常用的卵巢切除联合应用激素的建模方法，在评价股骨近端BMD变化的基础上，采用micro-CT技术和组织学观察来评价该方法对绵羊股骨近端微观结构的影响作用，进一步评价该方法建立髋部骨质疏松动物模型的效果。借鉴WHO关于人骨质疏松的诊断标准[2]，以BMD下降25%作为评价模型是否成功建立的标准。本实验中，通过去势手术联合激素注射综合处理12月后，绵羊股骨近端的BMD较前有显著的下降(P<0.05)，且平均下降大于25%(31.7%)。通过micro-CT分析和组织学观察，卵巢切除联合应用激素后绵羊股骨近端的骨小梁数量显著减少，骨小梁断裂增多，骨小梁间隙增大，失去典型的髓腔结构，骨组织空间结构变差，局部骨质条件显著下降。

通过研究我们认为，卵巢切除联合应用激素的方法可以显著降低绵羊股骨近端的BMD，显著破坏绵羊股骨近端的微观结构，显著降低局部的骨质条件。卵巢切除联合应用激素的方法可用于建立髋部骨质疏松动物模型。

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