张伟斌陈丹马伟钦何兴祥陈羽王丽京

结直肠癌有无肝转移血清差异蛋白质表达的研究*

张伟斌①陈丹①马伟钦①何兴祥①陈羽①王丽京②

目的：利用蛋白质组学技术分离、鉴定结直肠癌有无肝转移患者血清中差异蛋白质，筛选诊断肝转移的血清蛋白标志物。方法：根据入组条件，收集结直肠癌无肝转移病例、有肝转移病例，在两组中随机抽取12例血清样本，同组血清等量混合进行双向凝胶电泳，建立两组血清蛋白质双向电泳图谱，用Image-Master V5.0软件寻找两组差异蛋白质点，MALDI-TOF-MS对差异蛋白质进行鉴定，查询生物信息数据库对差异蛋白质进行初步分析。结果：两组比较差异在2倍以上蛋白质有8种，其中5个蛋白质表达上调，3个蛋白质表达下调；两组每个差异蛋白灰度体平均值比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。通过数据库搜索鉴定出7种蛋白质，上调的5个蛋白质分别是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指导的DNA合成酶）、Conserved hypothetical-protein（假定蛋白质）、SEC14L1 7 kDa protein；下调的2个蛋白质分别是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。结论：结直肠癌有无肝转移患者血清中的蛋白质表达谱有一定的差异性，这些差异蛋白质可能成为诊断肝转移的血清标志物。

结直肠癌； 肝转移； 差异蛋白质

近年来大量统计资料表明，在我国结直肠癌肠癌发病率和死亡率逐年升高尽管诊疗新技术不断改进和化疗药物的更新，其整体治疗水平仍不尽人意，主要原因是在行根治性手术前出现了肝脏的转移。因此，早期有效地诊断结直肠癌肝转移具有重要的临床意义，是彻底改变结直肠癌预后的关键措施。本研究利用蛋白质组学技术筛选及鉴定结直肠癌肝转移关键血清蛋白标志物，进一步了解结直肠癌肝转移机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年5月-2011年11月本院经病理明确诊断为结直肠癌的患者88例，并且患者既往无其他肿瘤，术前未接受过放疗、化疗等治疗；无姑息性手术者；无肝炎、肝硬化、原发性肝癌以及急慢性炎症性疾病等影响血清蛋白含量的相关疾病患者。影像学检查（B超、CT或MRI）检查发现有肝转移灶者为结直肠癌有肝转移组，无发现肝转移灶者为结直肠癌无肝转移组。均征得患者同意入组。88例直肠癌患者中直肠癌38例，结肠癌50例；无肝转移患者62例，伴肝转移患者26例。结直肠癌无肝转移组男33例，女29例，平均年龄（55.8±13.8）岁；结直肠癌伴肝转移组男11例，女15例，平均年龄（58.1±8.7）岁。两组患者的年龄、性别等比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂、仪器、软件 硫脲、除高峰度蛋白试剂盒、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠，尿素、Tris碱、3-[3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、溴酚蓝、甘油、十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、低熔点琼脂糖、固相pH值干胶条、蛋白质纯化试剂盒、定量试剂盒、考马斯亮蓝、冰醋酸（glacial acetic acid）、丁醇（butanol）。DU530型核酸/蛋白分析仪（美国 Beckman）；IPGphor等电聚焦仪，Ettan DALT six大型垂直电泳系统、扫描仪ImageScanner和LabScan软件（Amersham Biosciences）；质谱仪Ultraflex III（美国布鲁克）等。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质样品制备 早晨抽取研究对象空腹静脉血5 mL于干燥管收集，干燥管编号，记录患者信息。37 ℃静置30～60 min，3400 rpm离心15 min，取上层清亮透明血清，在这个过程中应尽量避免发生溶血，如若溶血标本，弃去。每个EP管500 μL血清分装，并编号，-80 ℃冰箱保存备用。结直肠癌无肝转移及伴有肝转移组分别随机选取各12例标本，同组标本取等量混合，除高丰度蛋白，Clean-up kit纯化后用Quant kit测定蛋白浓度。

1.3.2 双向电泳 第1向等电聚焦，上样量总体积为460 μL（含总蛋白质500 μg）；以13 200 rpm 4 ℃离心30 min，去上清液；放置IPG胶条并确保胶条与样品之间无气泡，胶条吸胀15 min；依次经过30 V 12 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000 V 6 h、2000 V 10 h。等电聚焦结束后，将IPG胶条置于平衡缓冲液中15 min。将平衡好的胶条转入垂直电泳槽中进行第2向电泳。后考马斯亮蓝G-250染色对电泳凝胶进行染色。

1.3.3 凝胶图像扫描与分析 用Image Scanner扫描仪同一参数（300 dpi）扫描并用Image Master V5.0进行图像分析，对胶上蛋白质斑点通过编辑，背景消除，分析胶间的匹配，获取差异蛋白点.

1.3.4 差异蛋白点肽质量指纹分析及鉴定 挖取出差异蛋白质点，进行蛋白质胶内酶解后获得蛋白质酶解肽段，将肽段点样于MALDI板上，进行MALDI-TOF/ TOF-MS鉴定分析。Mascot软件检索Human的IPI蛋白质数据库，参数设置如下：种属为human，切割酶combined，允许的未酶切位点数为1，酶为胰蛋白酶，MS的误差30 ppm，MS/MS的误差为0.2 Da。MS 和MS/MS结果联合搜索，得分超过63分为超过阈值（P＜0.05），为可信的鉴定结果，并根据质谱结果，通过数据库鉴定出蛋白质。

1.4 统计学处理 测定结果输入计算机，数据采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双向电泳结果 实验进行3次重复，银染显色后得到两组共6张背景清晰、分辨率高的银染凝胶图谱（图1、图2），后用图像分析软件Image Master 2D Platinum对图像进匹配分析。在匹配分析过程中得到具有差异蛋白质局部放大图（图3）以及其三维空间图（图4）。在匹配分析中选择差异倍数大于2倍以上为差异蛋白质。分析示有8个差异蛋白质点表达，其中肝转移组中5个蛋白质点表达上调且大于2倍的，3个蛋白质点表达下调调且大于2倍，并计算8个差异蛋白点3次电泳胶的灰度体平均值，两组每个差异蛋白灰度体平均值比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 差异蛋白质的质谱图及鉴定 从肝转移组凝胶中切下的8个差异表蛋白质点，进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定，获取的质谱图（图5、图6）。

并经过Mascot软件检索human的IPI蛋白质数据库，按Mascot得分、匹配的片段数和覆盖率等进行综合评判搜索结果见表2。

图1 结直肠癌无肝转移组

图2 结直肠癌有肝转移组

图3 差异蛋白点局部放大图

图4 2459号差异蛋白点三维空间图

3 讨论

近年来利用手术切除标本、患者血液、肿瘤细胞等作为研究对象，发现结直肠癌肝转移与多种蛋白有关[1]。结直肠癌在向肝转移过程中癌组织会分泌多种蛋白质入血清，而其他器官和组织受到肿瘤影响也会分泌蛋白质，因此从血清蛋白质组学角度进行研究很可能会发现一些与肿瘤发生发展相关的特异性血清标志物，目前利用血清蛋白质组学研究肿瘤发生和转移癌症的有乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等[2-5]。本研究利用蛋白质组学技术分离、鉴定结直肠癌有无肝转移患者血清中差异蛋白质，并通过数据库搜索鉴定出8种蛋白质（其中有2个蛋白质同为Haptoglobin），5个上调的蛋白质分别是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指导的DNA合成酶）、Conserved hypothetical -protein（假定蛋白质）、SEC14L1 7 kDa protein；2个下调的蛋白质分别是

Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。

表1 差异倍数大于2倍以上差异蛋白质点及灰度值比较

图5 有肝转移组Match ID 2052质谱图

图6 有肝转移组Match ID 2459质谱图

表2 鉴定的差异蛋白质结果

Transferrin产生的主要器官是肝脏，它是一种重要的β-球蛋白，是体液中不可缺少的成分，是细胞生长和增殖所必需的生长因子。有报道发现，Transferrin能改变细胞的黏附能力，促进肿瘤的复发和转移，并且在肿瘤和癌细胞中Transferrin的受体含量显著高于其相应的正常细胞[6-7]。另有研究通过对高危乳腺癌的术后血清进行SELDI-TOF MS表达谱分析，发现复发转移后血清中蛋白质Transferrin上调，提示其对转移具有独立预后意义[8]。李祖国等[9]通过建立裸鼠结直肠癌肝转移模型并应用血清蛋白质组学技术观察肝转移前后血清蛋白的变化，结果示结直肠癌肝转移后血清中Transferrin显著上调。所以笔者分析当结直肠癌细胞生长时，其表面Transferrin受体的密度迅速增加，待携带受体的癌细胞浸润入血后，与在肝脏产生Transferrin结合并沉积在肝脏形成转移，Transferrin可能是促进结直肠癌转移相关的蛋白。另一种上调的蛋白质RNA-directed DNA polymerase是逆转录酶，目前认为是正常细胞转化为恶性细胞的关键因素，已经有学者通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶表达率和表达水平显著增高，可作为结直肠癌肝转移的标记物[10]。下一步也可通过荧光定量等技术检测肝转移组血清RNA directed D-polymerase上调的表达率和表达水平，为监测结直肠癌肝转移筛选一个可靠的蛋白标志物。上调的Complement component C9是一种非特异性蛋白，在肿瘤免疫中作用受到重视，研究表明肝癌患者血清C9水平明显升高，可作为AFP阴性肝癌敏感的、特异的肿瘤标志物之一[11]。本研究中结直肠癌有肝转移患者血清中上调倍数最大的蛋白质是Conserved hypothetical protein，它是通过直接测序或由cDNA序列翻译之后，得到的蛋白质序列，该序列中存在有某种特定功能的一段保守序列，笔者推测这段保守序列的特定功能可能是引起结直肠癌肝转移的关键步骤，将对其重点研究。

在本研究中发现结直肠癌有肝转移患者血清中下调的蛋白质是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。Haptoglobin是血清中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于人类的血清中，其功能是作为一种急性期蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用，其在感染、创伤、炎症、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著升高。其能促进新生血管的内皮细胞生长和分化[12-13]。另它能通过与游离血红蛋白结合形成复合物，复合物运至肝脏后它就迅速被肝细胞从血液清除并释放血红蛋白，可导致其降低，所以有研究报道肝硬化癌变过程Haptoglobin由高到低[14-15]。本研究结果示Haptoglobin降低，结合其功能，笔者推测在结直肠癌患者未发生肝转移时期，Haptoglobin促进肿瘤血管生成，当肿瘤血管生成达到一定程度时，Haptoglobin与游离血红蛋白结合形成复合物携带肿瘤细胞入血，经过肝脏时复合物中的Haptoglobin被肝细胞清除，血清中Haptoglobin降低，但肿瘤细胞定植在肝脏形成转移瘤。而本研究特殊情况是Haptoglobin在双向电泳中显示为不同的位置，说明结直肠癌肝转移过程可能还同时伴有蛋白质修饰的改变参与其中。另下调蛋白质Isoform 1 of Serum albumin是血清白蛋白的异构体，白蛋白属于非急性时相蛋白，在维持血液胶体渗透压，体内代谢物质转运及营养等方面起着重要的作用，即使肝脏停止合成，8 d后外周血中浓度仅降低20%，由于肝脏有很强的代偿能力，半衰期较长，只有当肝脏病变和病程达到一定程度后才能出现白蛋白的改变。本研究示当结直肠癌出现肝转移时Isoform 1 of Serum albumin下调，考虑肝转移后肝细胞受到破坏，即引起其变化，如定期监测，就可早期发现有无肝转移，但具体机制有待进一步研究。

综上所述，结直肠肠癌肝转移的形成是一个多步骤的复杂过程，涉及到多个基因和多个蛋白的相互协同或拮抗作用。本研究的8种差异蛋白质可能在结直肠癌肝转移相关基因的突变、激活，癌细胞的粘附、迁移、增殖，细胞外基质降解，组织免疫性及肿瘤血管增生因子等过程中起到一定作用。笔者已经将2种差异蛋白质Transferrin、Haptoglobin构建人工神经网络模型，建立结直肠癌肝转移诊断模型，并通过横断面验证其有较高的准确度。故对这些差异蛋白质的进一步研究，便可早期筛选结直肠癌肝转移的血清标志物。

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A Research Study of the Serum Proteomics Expressions on Liver Metastases Value in Colorectal Carcinoma/

ZHANG Wei-bin，CHEN Dan，MA Wei-qin，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：001-006

Objective：To use proteomics separation method identify colorectal carcinoma patients’ serum proteins， so as to differentiate and diagnostic the serum protein biomarkers for liver metastases.Method：According to inclusion criterion， patients had been divided into colorectal cancer patients with liver metastases， and patients without liver metastases. Two groups were be randomized into 12 serum samples， same amount of serum proteins were mixed in each group by two-way clear gel electrophoresis， followed by building two sets of two-dimensional electrophoresis pattern. Image-Master V5.0 software was used to find the differences between two samples. Kam proteins were differentiated by Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. The differentiated expressed proteins in given bioinformatics databases was analyzed.Result：The colorectal liver metastases group and the non-colorectal liver metastases group showed that eight proteome were spotted with more than two differentials， of which five proteins were up-regulated and two were down-regulated. Each protein gray body average differences between the two groups had statistical significance （P＜0.05）. Five up-regulated proteins were： Transferrin， Complement component C9，RNA directed DNA polymerase， Conserved hypothetical-protein， SEC14L1 7 kDa protein； two down-regulated proteins were Haptoglobin and Serum albumin Isoform 1.Conclusion：Serum protein expression spectrum shows differential in colorectal carcinoma patients with liver metastases. This differential may be the diagnostic serum biomarkers for liver metastases.

Colorectal Carcinoma； Liver Metastasis； Proteomics

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.001

2014-05-03）（本文编辑：蔡元元）

国家自然科学基金（61201437）；广东省医学科研基金项目（A2011315）；广东省高等学校高层次人才项目（粤教师函[2010]79号）

①广东药学院附属第一医院 广东 广州 510080

②广东药学院血管生物学研究所

何兴祥

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China