杨振宇 俞天乐 周 瑶 张浩平 冯 晶

（上海出入境检验检疫局，上海 200131）

含可溶物干玉米酒糟（Distillers Dried Grainswith Solubles，以下简称DDGS）主要指现代化燃料酒精工厂，干法生产燃料酒精过程中，用玉米子实与精选酵母混合发酵生产酒精和二氧化碳后，剩余的发酵残留物通过低温干燥形成的一种共生产品［1］，可作为牲畜和家禽日粮的组分［2］。然而，由于真菌霉素污染等问题，DDGS的使用一直受到限制。玉米中可能存在多种真菌毒素，包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、伏马菌素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮（ZON）等。这些毒素大多在收获之前生成于玉米中。由玉米制成的DDGS水分含量高，霉菌容易生长，也会造成真菌霉素含量增高［3-4］。此外，DDGS生产过程不但不会去除真菌毒素，而且会浓缩富集，导致DDGS中真菌霉素的含量为原料玉米中的3倍［5］。

饲喂含有真菌毒素的饲料会导致家畜免疫力低下、病患率升高，生产性能下降［6］。所以世界各国，包括中国都制定了饲料中一部分真菌毒素的限量［7-10］。国标中没有针对DDGS的限量要求，目前仅有对玉米的限量：黄曲霉毒素B1≤50μg／kg、赭曲霉毒素A≤100μg／kg和玉米赤霉烯酮≤500μg／kg。脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2只有配合饲料的限量（最严格为 1 mg／kg）。

真菌毒素的检测方法很多，主要有薄层色谱法［10-14］、酶联免疫法［13-17］、液相色谱法［18-21］等。国标规定的部分真菌毒素的检测方法也都采用了这3种方法。但是，这些方法存在着一定缺陷。如薄层色谱法、酶联免疫法只是半定量方法，液相色谱法定量较为准确，但定性能力不足，而且这些方法都只能检测某一种或者某一类最多4种真菌毒素。液相串联质谱（LC-MSMS）技术大大增强了定性定量能力，在真菌毒素分析方面成为目前最先进的分析技术［22-24］。本试验以液相串联质谱技术同时检测DDGS中15种真菌毒素。该方法只需1次净化，过程简单快速，定性定量准确。使用该方法对入境的DDGS样品进行检测，通过对结果分析并进行分布拟合，首次提出了入境DDGS中真菌毒素的风险评价结论。

1 材料与方法

1.1 试剂

水：密理博纯水机生产的一级水；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵（色谱纯）：国药集团；真菌毒素标准品黄曲霉毒素 B1（AFT B1）、B2（AFT B2）、G1（AFT G1）、G2（AFT G2）、杂色曲霉毒素（ST）、玉米赤霉烯酮（ZON）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Ac-DON）、镰刀菌烯酮（FX）、二醋酸熏草镰刀菌烯醇（DAS）、新茄病镰刀菌烯醇（NEO）、T-2毒素（T-2）、毒素（HT-2）：奥地利 biopure公司，用乙腈配制成10 mg／L的标准溶液。

1.2 仪器和设备

TSQQuantum Ultra液相串联质谱仪：配ACCELA液相色谱，Thermo fisher公司；Allegla X-22R高速离心机：Beckman Coulter公司；PT2100均质仪：Poly TRO公司；QGC-12T氮吹仪：泉岛公司；890／H超声仪：Elma公司；Myco 226多功能净化柱：ROMER公司；0.22μm有机相针式滤膜：CNW公司。

1.3 前处理试验方法

准确称取DDGS样品5 g左右到50 mL塑料离心管中，加入25 mL乙腈水溶液（86∶14），用均质仪在20 000 r／min下均质1 min，然后超声提取30 min，在4 000 r／min转速下离心5 min，收集上清液。加25 mL乙腈∶水（1∶1）到残存固体中，在涡旋振荡器上振荡使固体均匀分散，然后超声30 min，在4 000 r／min转速下离心5 min。合并2次上清液至50 mL离心管中，加入乙腈至50 mL。混匀。

吸取10 mL上清液过Myco 226多功能净化柱，准确吸取过柱的净化液5 mL，在60℃水浴氮吹至近干。然后用1 mL甲醇醋酸铵水溶液（甲醇：10 mmol醋酸铵水溶液为1∶1）溶解，过膜至进样瓶中，用LCMSMS测量，外标法定量，结果需经回收率校正。

1.4 仪器试验方法

仪器检测分2次。1次为正离子模式，检测AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2、ST、DAS、NEO、T-2、HT-2；1次为负离子模式，检测 ZON、DON、NIV、3-AcDON、15-AcDON、FX。色谱柱采用 Thermo公司Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm×1.9μm）PFP色谱柱；柱温：35℃；进样量：10μL；流动相甲醇水梯度洗脱。离子设置见表1。AFT B1、B2、G1、G2的标准曲线范围均为0～4μg／L；DAS的标准曲线范围为0～10μg／L；T-2、HT-2、ST、NEO的标准曲线范围为0～20μg／L；ZON的标准曲线范围均为0～100 μg／L；DON、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON的标准曲线范围为0～1 000μg／L。

表1 15种真菌毒素的性质

2 结果与分析

2.1 方法指标及验证

由于不同的真菌毒素在质谱上形成离子的情况不同，而且离子化试剂、流动相分离效果也不同。本研究将真菌毒素分成正负2类来检测，这2类毒素在质谱上的检测参数都不完全相同，分组详见1.4节。15种真菌毒素色谱图见图1、图2。

图1 正离子模式的色谱图

图2 负离子模式的色谱图

本研究对方法进行了验证。15种真菌毒素标准曲线的相关系数都在0.99以上，线性良好。

根据精密度、色谱图干扰情况等方面的综合考虑，15种真菌毒素的定量检出限（LOQ）估计值见表2。

表2 15种真菌毒素的定量检出限／μg／kg

本研究通过对真菌毒素含量较低的DDGS样品进行加入已知浓度标准品以验证方法的回收率和精密度（n＝6）结果见表3～表6。

表3 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的添加回收和精密度结果／%

表4 T-2、HT-2、ZON和ST的添加回收和精密度结果／%

表5 NEO、DAS和FX的添加回收和精密度结果／%

表6 DON、NIV、3-AcDON和15-AcDON的添加回收和精密度结果／%

由表3～表6可以看到，不同真菌毒素的回收率并不相同，但是相对标准偏差均小于15%。造成部分真菌毒素回收率较低的原因可能是过柱造成的回收率损失；液质的基质抑制效应。相对偏差较小说明方法具有较好的重现性，所以可以采取回收率校正的方式定量。本研究采用的15个真菌毒素的数据均是对实际检测值用平均回收率校正后的结果。

本研究还对2种有证标准物质（CRM）进行了检测。每个样品检测3次，检测结果见表7。

表7 有证标准物质的检测结果／μg／kg

从表7可以看到，结果均在有证标准物质的标称值之内，说明本方法准确度可靠。

2.2 检测结果

本研究抽取了从上海进口的67件DDGS样品，按照本研究建立的检测方法进行检测。AFTB2、AFT G1、AFTG2、DAS、NEO、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON结果均小于检出限，而AFTB1有16个样品有检出，均小于5μg／kg，离限量50μg／kg比较远；ST有17个样品有检出，均小于4μg／kg，这些数据结果不再讨论。所有样品的DON、ZON、T-2、HT-2都有检出，统计结果见表8。由于T-2、HT-2属于一类毒素，同时统计了T-2类总量。

2.3 T-2、HT-2毒素的含量结果分析

表8的数据中，T-2类毒素的总量是由T-2和HT-2的含量加和得到。可以看出，T-2、HT-2大概成线性关系，拟合直线图见图3。其线性方程为Y（HT-2）＝0.966＋1.652X（T2），相关系数为0.980。

表8 T-2、HT-2、ST、DON、ZON含量统计结果

图3 T-2和HT-2的线性拟合图

可以看到，T-2、HT-2含量之间的相关性非常好，两者的比例大约是 8（HT-2）：5（T-2）。其中HT-2占到了62%。

另外，本研究还使用＠Risk ver 5.7软件模拟了T-2类总量的分布，得到的图形和拟合曲线见图4。

图4 T-2类总量的拟合分布

从图4可以看到，DDGS中T-2类总量可以用Person 5分布来模拟。通过模拟的分布曲线，也可以得到目前上海口岸进口的DDGS的T-2和HT-2有95%可能性不会超过75μg／kg；99%可能性不会超过185μg／kg。

2.4 DON、ZON毒素的含量结果分析

表8的数据说明了DON、ZON均有检出。其中DON和ZON也有一定的正相关关系。具体拟合直线见图 5。其线性方程为 Y（DON）＝-16.34＋0.43X（ZON）相关系数为0.843。说明存在着高含量的DON，也存在着高含量的ZON，反之亦然。

图5 DON和ZON的拟合直线

除了以上T-2类毒素以及DON和ZON之间存在着相关性以外，其他毒素之间的关系均未发现有相关性。由于DON主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生，二者也是产生ZON的菌种，所以二者同时出现的概率很大，本研究所得到二者的结果有一定的相关性，也是很自然的。

另外，类似于T-2类总量的处理，使用＠Risk ver 5.7软件模拟了ZON和DON的分布，得到的图形和拟合曲线分别见图6和图7。从图6～图7可以看到，DDGS中ZON和DON含量均可以用Invgauss分布来模拟。通过模拟的分布曲线进行概率计算，可以得到目前上海口岸进口的DDGS的ZON有95%可能性不会超过183μg／kg；99%可能性不会超过241μg／kg。DON含量有95%可能性不会超过406 μg／kg；99%可能性不会超过535μg／kg。

图6 ZON的拟合分布

图7 DON的拟合分布

从数据分析可以看到，DDGS中含有一定量的DON和ZON，参照饲料卫生标准，可以看到这2种真菌毒素99%的概率不会超过限量的一半。而T-2和HT-2的总量也不会超过配合饲料限量（1 mg／kg）的20%。

3 结论

本研究建立了液相串联质谱检测玉米酒糟粕中多种真菌毒素的检测方法，采用乙腈水溶液提取，用Myco-226柱净化，LC-MS-MS检测。检测的真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、杂色曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮、二醋酸熏草镰刀菌烯醇、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等15种。方法均经过优化和验证，定性定量准确，满足进口玉米酒糟粕的检测要求。

根据对67个进口美国玉米酒糟粕样品的检测结果，发现这些样品中玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等真菌毒素均有检出。本研究对这些数据进行了统计分析，可以得到以下结论：T-2和HT-2含量相关系数达到0.980；DON和ZON含量相关系数达到0.843。另外，DON、ZON、T-2类超出限量的可能性不大。而这些毒素的协同作用造成的危害目前仍然是空白。总体而言，DDGS中存在着一定水平的真菌毒素含量，在作为饲料配料时要了解其含量水平，选用毒素含量低的DDGS，优化配方，保证饲料的安全。

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