田洪磊 詹 萍 朱新荣 颜海燕

（石河子大学食品学院，石河子 832000）

机体自由基的产生贯穿于整个生命代谢周期，抗氧化酶及其他各类抗氧化剂的存在为人体中抗氧化网络的构建与完善及抗氧化平衡状态的维护起到了至关重要的作用［1-2］。自由基产生与抗氧化防御系统的失衡直接诱导氧化应激状态的发生发展，超氧阴离子等自由基的过多累积所导致的氧化应激型代谢紊及组织损伤等问题，是机体衰老、各种慢性疾病（如肿瘤、心血管疾病及糖尿病等）产生的主要根源［3］。近年来在人工合成抗氧化剂等食品添加剂的食用安全性受到普遍关注的同时，基于特色食品资源及其加工副产物进行天然抗氧化物质筛选与抗氧化剂制备已成为功能食品研究领域的热点问题，富含多种生物活性物质的植物精油等天然复合基材为天然抗氧剂产品开发提供了丰富而便捷的资源样本。作为多种脂肪酸及植物甾醇等物质组成较为复杂的新疆小白杏杏仁油，以其在多种疾病尤其是地方病干预治疗方面的显著效果，长期被维吾尔医师作为一种药物普遍使用，然而目前对其作用效果及机制的解析尚待填补或完善，在小白杏杏仁油资源样本中生物活性物质鉴定分析的基础上，对其清除自由基效果进行对照研究，预期通过抗氧化活性评价为多种疾病干预治疗效果提供可靠解析或理论依据，从而有望在充实或补充天然抗氧化剂种类的同时，提升新疆区域特色资源的精深加工程度，推动区域资源优势向经济优势转变的进程。

在对复杂生物活性物质天然复合而成的小白杏杏仁油进行抗氧化活性研究的基础上，结合相关分析方法对其中多样活性物质单体与抗氧化指标之间的量效关系进行预测，可避免通过各种活性物质精确分离后进行抗氧化效果对比研究的复杂繁琐过程，预期在节约研究成本的同时研究探讨建立复杂生物活性物质样本体系量效关系评价方法。PLRS分析法已被广泛用于不同数据集之间的相关性研究，此方法主要通过分析复杂多变量体系组成的样本集与有限几种指标集之间的多重共线性进行量效关系预测［4-5］。目前鲜见关于新疆小白杏杏仁油药食两用资源的量效关系研究方面的报道，本研究结合项目组前期在小白杏杏仁油制备方法研究过程中所获得研究成果，分别采用超临界CO2萃取、机械压榨、超声波辅助提取及索氏提取的方法制备生物活性物质含量不同的小白杏杏仁油样本，并采用GC-MS技术对不同样本中脂肪酸、植物甾醇及VE等多种生物活性物质组分进行鉴定，再次对以上不同小白杏杏仁油样本进行DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基及ABTS自由基清除效果研究，结合PLSR分析法对复杂生物活性物质组成的小白杏杏仁油进行抗氧化活性量效关系研究，旨在通过新疆小白杏杏仁油抗氧化活性及量效关系研究，为新疆小白杏功能产品开发及复杂天然产物体系生物学功能研究的方法改进提供坚实的理论依据或借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

小白杏杏仁：采集库车县成熟的小白杏鲜杏，整理收集小白杏杏仁，清水处理后进行烘箱干燥［干燥温度（50±2）℃］，并将其分别粉碎至30目及60目（30目粉碎样品用于超临界萃取，60目粉碎样品用于其他3种提取方法），低温（-20℃）密封储存备用。内标物质（十九烷酸、角鲨烷）：美国Sigma化学试剂公司；甲苯：色谱级，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；DPPH及ABTS自由基：Sigma公司；正构烷烃混合标样（C6-C26），其他试剂：均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

HA121-50-02超临界萃取设备：江苏华安科技股份有限公司；气相色谱质谱联用仪：美国Finnigan质谱公司；KESP-100KH超声波萃取器：深圳科工达超声设备有限公司；Carver12224-96液压榨油机：美国Freds液压设备公司；FW80微型高速试样粉碎机：河北省黄骅市新兴电器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 小白杏杏仁油的制备

小白杏杏仁油不同制品方法条件见表1。

表1 小白杏杏仁油不同制备方法条件

1.2.2 制备脂质体样品脱胶处理方法

设置水与待脱胶样品体积比例为18% （W／O），温度为65℃进行水浴搅拌脱胶10 min，冷却（4℃）后离心分离（2 800×g）12 min，脱胶分离的各脂质体样品采用无水Na2SO4进行脱水后低温贮藏备用。

1.2.3 小白杏杏仁油中主要生物活性成分的测定

脂肪酸的测定参见文献［10］。

甾醇及VE等其他物质测定方法如下：准确称取2.0 g油样，加入100 mL浓度为1 mol／L的氢氧化钾-甲醇溶液，在85℃水浴条件下回流加热皂化1 h后冷却至室温（25℃）后，从中吸取5 mL，加入2 mL蒸馏水，用5 mL石油醚提取3次后，合并醚液，并将醚液蒸干，用2 mL吡啶溶解，再加入2 mL乙酸酐，静止3 h后加入蒸馏水10 mL，冷却后1 mL正己烷定容，待测。GC-MS分析条件：OV-1701毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，液膜厚度0.25μm），载气（He）流量：0.8 mL／min，分流比：12∶1，进样口温度：280℃，起始柱温240℃，以10℃／min的升温速率升至265℃保持48 min。质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，发射电流150μA，检测器电压350 V，进样量：0.5μL。

1.2.4 小白杏杏仁油抗氧化性能

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

将DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基肼，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基溶于95%的无水乙醇配成0.1mmol／L的待清除溶液，分别用无水乙醇将不同方法制备的小白杏杏仁油样品及VE对照品稀释成质量浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg／mL的溶液，取上述各溶液2mL分别加入到2mL 0.1mmol／L的 DPPH配制溶液中［11］，室温（25℃）暗室条件下水浴摇动20 min后取出，在517 nm处10 min内测定吸光值，并用2 mL去离子水配成的同浓度DPPH溶液作为对照，蒸馏水做空白对照，相关检测做3次重复（其他自由基清除效果研究同样重复对照）。DPPH自由基清除能力计算公式：清除能力＝［A0-（A1-A2）］／A0×100%，式中：A0为添加样品前DPPH溶液吸光度；A1为添加样品后的DPPH溶液吸光度；A2为样品吸光度。采用各样品达到最大抑制率一半（IC50）时的样品浓度评价样品清除自由基的效果［12］。

1.2.4.2 羟基自由基清除能力

采用2-脱氧-D-核酸糖-氧化法研究小白杏杏仁油对羟基自由基的清除效果［12］，依次在反应试管中加入0.4 mL KH2PO4-KOH缓冲液（pH＝7.4），0.1 mL以上不同浓度样品溶液及 EDTA（1 mmol／L）、双氧水（10 mmol／L）、2-脱氧 -D-核酸糖（60 mmol／L）、抗坏血酸（2 mmol／L）、三氯化铁（1 mmol／L）溶液，并用0.1 mL蒸馏水代替三氯化铁溶液做空白对照，28℃条件下反应90 min后加入1 mL三氯乙酸（20%）终止反应，然后加入1 mL硫代巴比妥酸溶液（1%），混合均匀后在沸水浴（100℃）中保持15 min，冰浴后在532 nm处测定吸光值［13］。

1.2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力

依据生物活性物质经过超氧阴离子氧化还原反应失活形成呈色产物的原理［14-15］，将0.1 mL不同浓度的小白杏杏仁油样本溶于2.8 mL的Tris-HCl-EDTA缓冲液（0.1 mol／L，pH＝8.2）中，25℃条件下混合20 min后加入0.1mL邻苯三酚（3 mmol／L），相同温度条件下反应5 min加入1 mLHCl溶液（8 mmol／L）终止反应，在299 nm处测定吸光值，计算清除率。

1.2.4.4 ABTS自由基清除能力

采用Floegel等［15］方法进行不同小白杏杏仁油样品清除ABTS（2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉 -6-磺酸，2，2＇-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate））自由基的对照研究，通过34 mg K2S2O8及52 mL蒸馏水配置K2S2O8储备液，取储备液5.2 mL加入20 mg ABTS，制的ABTS母液暗室放置12 h后，取0.8 mL用甲醇定容至50 mL，得ABTS待用液，取2 mL ABTS待用液分别加入到2 mL不同浓度的小白杏杏仁油样品及VE对照品中，并用相同体积的甲苯-甲醇溶液（1∶1）形成空白对照组，各反应样本室温（25℃）振荡0.5 min后避光密封放置30min，在734 nm处测定吸光值，计算清除率。

1.3 数据统计分析

对测定结果采用SPSS20.0软件进行Duncan多重比较检验和方差分析（ANOVA），P＜0.05认为存在显著性差异。相关性分析采用偏最小二乘回归法（PLSR），所有数据均进行3次平行试验。

2 结果与分析

2.1 不同方法制备新疆小白杏杏仁油主要生物活性物质分析

如表2、表3所示，通过对4种不同方法制备的小白杏杏仁油样品进行生物活性物质鉴定，发现各样品中生物活性物质含量丰富且存在差异，包括脂肪酸、甾醇及VE等50余种物质组分，为了后期分析的便捷性及对照研究的需要，将含量甚微（峰面积＜10 000）的成分删除，采用Xcalibur软件对色谱数据进行分析，通过对鉴定所得化合物与NIST及WILEY数据库中的已知化合物质谱数据比对（尽可能采用标准物质对检出物质进行比对），选取相似度（SI）和逆检索相似指数（RSI）＞800的物质比较其KI指数。通过对4组样品生物活性物质进行对照筛选，共获得共有活性物质33种，其中包括19种脂肪酸组分、14种甾醇及其他生物活性物质类组分，相关活性物质均呈显著差异性（P＜0.05，α-生育酚除外），与其他3种制备方法相比，SCDE法制备的样品中相关共有活性物质种类较为齐全。各样品脂肪酸中单不饱和脂肪酸（MUFA）质量分数在59.95%～68.90%之间，多不饱和脂肪酸（PUFA）质量分数在21.70%～25.36%之间。采用MCE制备的样品中顺式 -油酸Δ9、油酸Δ11、亚油酸Δ9，12、亚麻酸Δ6，9，12及亚麻酸Δ9，12，15的含量相对最高，十七烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸及亚油酸Δ8，11未检出；在其他3种方法制备的样品中顺式-油酸Δ9及亚油酸Δ9，12等脂肪酸组分亦保持了相对较高的含量，其中SCDE制备样品中硬脂酸、二十三烷酸、亚油酸Δ8，11及花生四烯酸Δ5，8，11，14含量相对稍有偏高，肉豆蔻酸及二十碳三烯酸Δ8，11，14未检出，UAE制备样品中棕榈酸、花生酸、花生一烯酸Δ11、二十二烷酸及二十四烷酸的含量相对较高，但亦存在亚油酸Δ8，11、二十三烷酸及花生四烯酸Δ5，8，11，14未检出的现象，同样在SE制备样品中棕榈油酸、反式 -油酸Δ9及二十碳三烯酸Δ8，11，14的含量呈现了相对较高的现象，花生四烯酸Δ5，8，11，14与二十四烷酸未检出。与脂肪酸组成相比，不同方法制备的小白杏杏仁油样品中甾醇及其他生物活性物质含量亦存在较为明显的差异性，采用SCDE制备的样品中β-谷甾醇Δ5、角鲨烯Δ2，6，10，14，18，22及 γ-生育酚含量相对较高，在其他3种方法制备的样品中α-生育酚、Δ5-燕麦 甾 醇Δ5，24（28）、Δ5-豆 甾 醇Δ5，22、Δ7-燕 麦 甾醇Δ7，24（28）、沉香萜醇Δ1，6、胆甾醇Δ5、菠菜甾醇Δ7，22、麦角甾醇Δ5及 Δ7-豆甾醇Δ7，22等分别亦表现了相对较高的含量状态。

表3 不同方法制备小白杏杏仁油中甾醇及其他生物活性物质

在较全面地对所选择的新疆小白杏杏仁油样品中生物活性物质进行分析鉴定后，发现小白杏杏仁油中确实存在多种物质成分，新疆少数民族居民长期采用其作为多种维吾尔药物配伍资源进行相关疾病干预，可能与某些生物活性物质的多元化组成相关，为提高小白杏杏仁油中生物活性物质生物学功能追溯的科学性，避免通过各种活性物质精确分离后进行抗氧化效果对比研究的复杂繁琐过程，复杂多变量体系组成的4种不同方法制备的小白杏杏仁油样品为相关单体成分功能作用的显著性与协同性研究或预测提供了相近但存在差异的研究样本。

2.2 小白杏杏仁油抗氧化活性

基于物质组分含量及协同作用效果的差异，不同制备样品可能存在清除能力变化的差异。试验中，小白杏杏仁油抗氧化活性通过对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基进行表征。通过对不同方法制备的小白杏杏仁油样品不同浓度的抗氧化能力测定，采用SPSS软件计算得出4种不同方法制备的小白杏杏仁油抗氧化能力的IC50值，结果见表4。

表4 供试样本抗氧化能力的IC50值对照

4种制备小白杏杏仁油样本及VE对照样本对于DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力。对于DPPH自由基，在质量浓度为0.05～0.2 mg／mL时清除效果变化最为明显，其中SCDE、SE及UAE制备样品在质量浓度达到0.8 mg／mL浓度时清除率基本达到最佳状态，其达到最大清除率50%的质量浓度（IC50）分别为0.134、0.191、0.321 mg／mL；MCE制备样品及VE对照品清除率在质量浓度达到0.4 mg／mL后有下降趋势，IC50值分别为 0.202、0.050 mg／mL；小白杏杏仁油样品对羟基自由基亦具有一定的清除能力，其中以SCDE制备样品最为明显，其 IC50值为0.190 mg／mL，与 VE IC50值（0.123 mg／mL）相比，SCDE制备样品清除羟基自由的能力较VE稍弱。所有考察样品对羟基自由基的清除能力均表现出相似的变化趋势，在0.05～0.8 mg／mL范围内，随样品浓度的改变羟基自由基清除率变化明显，继而提升样品浓度时清除率变化微弱，不同物质含量的样品所呈现的相似趋势可以反映某些物质组分与羟基自由基清除效果间可能存在相关性，或相近的制备样本自然形成了某种特定类型的协同作用体系；对于超氧阴离子清除效果，结果表明浓度较低（0.05～0.8 mg／mL）的情况下样品对超氧阴离子的抑制效果均明显高于VE对照组，在质量浓度达到0.8 mg／mL后，除VE对照组及UAE样品组外，其他3组样品浓度对超氧阴离子的清除率变化产生的影响不明显，与 VE对照组（IC50＝0.731 mg／mL）相比，SCDE、MCE及SE制备样品均显示了较强的超氧阴离子自由基清除活性（IC50值 0.578～0.721 mg／mL），UAE制备样品稍弱，其 IC50值仅为1.160 mg／mL；与此同时小白杏杏仁油样品对ABTS自由基亦具有一定的清除能力，其中以MCE制备样品最为明显，其IC50值为0.436 mg／mL，其他3种制备样品 IC50值在0.733～0.786 mg／mL之间，与 VE对照组（IC50＝0.278 mg／mL）相比，各制备样品对ABTS自由基的清除能力稍逊于VE。通过对各供试样本的IC50值比较亦可发现，与其他供试样本相比，UAE制备样品对相关自由基的清除效果均相对较弱，各供试样本对DPPH自由基的清除效果尤为明显。

2.3 显著相关性活性物质与抗氧化性能量化分析

在对差异性小白杏杏仁油样品进行抗氧化活性评价的基础上，为深入明晰或预测小白杏杏仁油样品中主要生物活性物质对小白杏杏仁油样品抗氧化性能的作用方式，采用ANOVA-PLSR方法建立了PLSR模型，对4种不同方法制备的小白杏杏仁油中的33种主要成分和4个抗氧化指标进行了相关分析。在对前期相关变量集合进行PLSR分析前，对所有原始变量进行标准化的预处理（1／Sedv），所有PLSR模型均采用全交叉验证法进行检验。以33种化合物为X变量，单个氧化应激指标为Y变量分别建立4个PLSR模型，根据Jack-knife不确定度检验分别计算得出的对Y变量（即4个抗氧化制备）具有显著影响的活性物质（P≤0.05），结果见表5。

然而，在实际操作过程中发现，与多种中药制剂的功效作用相似，小白杏杏仁油供试样本对4种自由基的清除效果不可能完全由某种单一的活性成分呈现，极有可能通过多种成分的协同作用完成，再者，复合体系中不同生物活性物质的功效阈值差异性较大。因此，为了更为直观的比较不同方法制备的小白杏杏仁油中相关活性物质与自由基清除效果间的量化关系，从上述显著活性物质中找出一些在不同方法制备的小白杏杏仁油样本中含量差异变化较大的组分尤为重要。在前期生物活性成分与抗氧化能力相关性明晰的基础上，选择传统索氏提取法制备的小白杏杏仁油样本（SE）为参照，以其中相关性分析显著的化合物的含量为基准，计算得出其他3种方法制备的小白杏杏仁油样本中相关性分析显著成分含量的差值系数，计算公式为：

式中：Y为各种显著化合物含量的差值系数；Cx分别为3种不同方法制备的小白杏杏仁油中各种显著化合物含量；C0为索氏提取制备小白杏杏仁油中相应组分含量。

通过比较差值系数，可以直观地表征不同方法制备的小白杏杏仁油中各种化合物之间的差值变化率，用来反映同一物质在不同方法中的差异程度。一般来说，结合PLSR模型确定的显著成分中，基准含量高的化合物可能是起主导功效的重要物质，而差值系数较大的物质则可能是导致不同样本产生差异功效的关键成分。具体量化结果如表5所示。

表5 具有显著特性的成分与自由基清除能力间的量化分析

由表5所示的PLSR模型的回归系数可以看出，与DPPH自由基清除能力强弱相关的显著化合物依次为角鲨烯Δ2，6，10，14，18，22（0.049 06）、γ-生育酚（0.045 86）、亚油酸Δ9，12（0.045 03）、顺式-油酸Δ9（0.044 00）、β-谷甾醇Δ5（0.043 93）、亚油酸Δ8，11（0.041 74）、菠菜甾醇Δ7，22（0.039 58）、α-生育酚（0.033 88）等。同时结合各种活性化合物的差值系数（按式（1）计算所得）进行比较分析，发现亚油酸Δ8，11（3.00）、亚麻酸Δ6，9，12（1.06）、花生三烯酸Δ8，11，14（1.00）、菠菜甾醇Δ7，22（0.67）差值系数变化相对较大，而其基准含量却相对较低（分别为0.04 g／100 g、0.15 g／100 g、0.14 g／100 g和 4.62μg／g），其他显著活性化合物，如顺式油酸Δ9（62.78 g／100 g）、亚油酸Δ9，12（21.5 g／100 g）基准含量较高，差值系数变化较小（分别为0.14和0.13），综合以上分析结果推断：角鲨烯Δ2，6，10，14，18，22为主导的小白杏杏仁油的DPPH自由基清除体系中，顺式油酸Δ9和亚油酸Δ9，12对于DPPH的亦存在显著清除效力，但导致4种方法制备的小白杏杏仁油样本对DPPH自由基清除效力存在显著差异，可能恰恰是由于以上基准含量相对较低的物质在其他3种制备样品中的差异性配伍与协同效力所造成的；按上述分析方法推测，角鲨烯Δ2，6，10，14，18，22（差值系数为 0.57）可能是小白杏杏仁油样本清除羟基自由基的关键物质，花生四烯酸Δ5，8，11，14可能是清除超氧阴离子自由基的关键物质，Δ5-燕麦甾醇Δ5，24（28）（1.00）和亚麻酸Δ6，9，12（1.06）可能是清除ABTS自由基的关键物质。

3 结论

通过GC及GC-MS技术对超临界CO2萃取、机械压榨、超声波辅助提取及索氏提取四种小白杏杏仁油制备样品进行了分析，共筛选获得了33种呈显著差异性（P＜0.05，α-生育酚除外）的活性物质；不同方法制备样品对 DPPH、羟基、超氧阴离子及ABTS 4种自由基均存在差异的清除能力。采用PLS1模型分析了具体活性物质与抗氧化指标之间的相关性，同时结合差值系数分析，初步推测角鲨烯Δ2，6，10，14，18，22、花 生 四 烯 酸Δ5，8，11，14、Δ5-燕 麦 甾醇Δ5，24（28）、亚麻酸Δ6，9，12可能分别在不同小白杏杏仁油自由基清除体系中起关键协同作用。

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