纪超，毕志刚

（1.南京医科大学第一附属医院，南京210024；2.南京医科大学附属南京明基医院，南京210019）

复方木尼孜其颗粒是一种维吾尔族传统药物，由菊苣子、芹菜根、香青兰子、黑种草子、茴香根皮、洋甘菊、香茅、罗勒子、蜀葵子、茴芹果等组成，有调节内分泌、增强免疫功能，治疗肝胆炎症、皮肤疾病、排除体内毒素等功效。近年来，在临床中应用于黄褐斑、痤疮、湿疹等多种皮肤病。但其治疗黄褐斑的作用机制目前并不清楚。

人肤色深浅主要由表皮中黑素细胞合成的黑素决定[1]，黑素合成增加是黄褐斑发病的重要原因，而酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成过程的关键酶、限速酶[2]，其活性与黑素合成量密切相关[3]。

小鼠B16 黑素瘤细胞是一种高度黑素化的黑素瘤细胞株,国际上常用于黑素合成的相关研究。因此，本实验以体外培养的小鼠B16 黑素瘤细胞为模型，研究复方木尼孜其颗粒对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。

1 材料与方法

1．1 材料 复方木尼孜其颗粒由广东天奥医药有限公司馈赠，批号：20060902。氢醌、左旋多巴、二甲基 亚 砜（DMSO）、胰 蛋 白 酶－EDTA （0．25%）、TritionX－100 均购自美国Sigma 公司，DMEM 培养液（高糖）、10%胎牛血清购自美国Gibco 公司。

1．2 方法

1.2.1 细胞培养 选择对数生长期的小鼠B16 黑素瘤细胞，待生长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，离心后用含有10%胎牛血清的DMEM 培养液传代于25 cm2培养瓶，置于CO2恒温孵箱37 ℃常规培养。

1.2.2 MTT 检测 将小鼠B16 黑素瘤细胞用含10%FBS 的DMEM 调整细胞浓度至2×104/mL，接种至96 孔培养板，每孔100 μL。在5%CO2，37 ℃恒温孵箱中培养24 h 后，再分别加入不同浓度的药物（氢醌组1 mg/L、复方木尼孜其颗粒低剂量组10 mg/L、复方木尼孜其颗粒中剂量组50 mg/L、复方木尼孜其颗粒高剂量组100 mg/L），并设置培养液空白对照组。培养72 h 后，于检测前4 h 加入MTT 20 μL/孔，4 h 后弃上清液，加入DMSO 100 μL/孔，振荡10 min，置酶标仪570 nm 波长处测A 值（A 值反应细胞情况）。每一浓度设立6 个复孔，实验重复3次。

1.2.3 细胞酪氨酸酶活性测定 在96 孔培养板加入B16 单细胞悬液调整细胞浓度至2×103/孔，待贴壁后加入不同浓度的药物，继续培养72 h，弃上清，用pH7.4 的PBS 洗涤2 次，每孔加1%TritonX-100溶液50 μL，迅速置-80 ℃冻存30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，37 ℃预温后加入0.2%L-多巴溶液50 μL，37 ℃反应2 h，测定490 nm 吸光度值。每一浓度设立6 个复孔，实验重复3 次。

1.2.4 黑素含量的检测 在96 孔培养板加入B16单细胞悬液调整细胞浓度至2×103/孔，待贴壁后加入不同浓度的药物，继续培养72 h，弃上清，用0.25%胰酶消化收集细胞,镜下计数。得到的细胞悬液1 500 r/min 离心5 min,弃上清,加入1 mL 1 mol/L的NaOH, 在80 ℃水浴保温2 h 后于490 nm 酶标仪测吸光度值。每一浓度设立6 个复孔，实验重复3 次。

1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0 软件进行分析，均应用计量资料t 检验分析，检测数据以均数±标准差表示，P<0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方木尼孜其颗粒对B16 细胞增殖率的影响氢醌组、复方木尼孜其颗粒低浓度组、复方木尼孜其颗粒中剂量组，以及复方木尼孜其颗粒高剂量组与空白对照组相比，B16 细胞增殖率均无明显改变，差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

2．2 复方木尼孜其颗粒对B16 细胞黑素合成的影响 氢醌组、复方木尼孜其颗粒高剂量组与空白对照组相比，均明显抑制B16 细胞黑素合成，差异有统计学意义（P＜0．05）；复方木尼孜其颗粒低浓度组、复方木尼孜其颗粒中剂量组与空白对照组相比，对B16 细胞黑素合成无影响，差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

2.3 复方木尼孜其颗粒对B16 细胞酪氨酸酶活性的影响 氢醌组与空白对照组相比，B16 细胞酪氨酸酶活性明显减少，有统计学意义（P＜0．05），但是复方木尼孜其颗粒低浓度组、复方木尼孜其颗粒中剂量组、复方木尼孜其颗粒高剂量组与空白对照组相比，B16 细胞酪氨酸酶活性均无明显变化，均无统计学意义（P＞0．05），见表1。

3 讨论

黄褐斑是一种常见的色素沉着性疾病[4]，色素沉着部位主要在表皮基底层，其发病机制主要与皮肤中黑素细胞活性增加，合成黑色素能力增强有关，目前尚缺乏特效治疗方法。酪氨酸酶是黑素合成过程中的限速酶[5]，其表达和活性决定了黑色素生成的量和速度[6]。若酪氨酸酶的活性受到抑制，黑素合成将减少，在一定程度上预防和治疗色素沉着。

本研究显示复方木尼孜其颗粒能够明显抑制小鼠B16 黑素瘤细胞的黑素合成，但是对小鼠B16黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性以及细胞的增殖无明显影响。提示临床上应用复方木尼孜其颗粒治疗色素沉着性皮肤病，如黄褐斑等，可能具有一定的开发应用前景。

同时，本研究也说明，目前对于促黑素合成的中药研究，多集中于对酪氨酸酶的活化方面,但可能有些中药的靶位点并非在酪氨酸酶，而可能作用于黑素代谢过程中其他环节。

表1 复方木尼孜其颗粒对B16 细胞增殖率、细胞黑素合成和细胞酪氨酸酶活性的影响

[1] Plensdorf S,Martinez J.Common pigmentation disorders[J].Am Fam Physician,2009,79:109-116.

[2] Jawaid S, Khan TH, Osborn HM, et al. Tyrosinase activated melanoma prodrugs[J].Anticancer Agents Med Chem,2009,9:717-727.

[3] De A, Mandal S, Mukherjee R. Modeling tyrosinase activity. Effect of ligand topology on aromatic ring hydroxylation:an overview [J].J Inorg Biochem,2008,102:1 170-1 189.

[4] Fistarol SK,Itin PH.Disorders of pigmentation [J].J Dtsch Dermatol Ges,2010,8:187-201.

[5] Decker H, Tuczek F. Tyrosinase/catecholoxidase activity of hemocyanins: structural basis and molecular mechanism[J]. Trends Biochem Sci,2000,25:392-397.

[6] Kemp EH, Weetman AP. Melanin-concentrating hormone and melanin-concentrating hormone receptors in mammalian skin physiopathology[J].Peptides,2009,30:2 071-2 075.