王琼, 唐俊妮, 汤承, 陈娟, 刘骥

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041)

针对不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株的agr I-IV分型初探

王琼, 唐俊妮, 汤承, 陈娟, 刘骥

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041)

目的:金黄色葡萄球菌附属基因调节子(agr)位点是一个全面的群集感应系统并且控制着毒力因子的产生, 本研究旨在针对不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株进行agr I-IV基因分型研究.方法:根据金黄色葡萄球菌agrI-IV基因组别类型的引物, 对五种不同来源的169株金黄色葡萄球菌DNA模板进行多重PCR扩增, 获得目的基因,以判断agr基因型.结果:169株分离菌株中,agrⅡ型的检出率为19%(32/169),agrⅢ型检出率为12%(20/169),agrⅣ型检出率为8%(14/169), 五种不同来源的金黄色葡萄球菌均有检出agrⅡ型, 均未检出agrⅠ型, 并且都含有未能分型的agr阴性菌株. 研究结果表明不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株中agrI-IV基因型的流行情况. 该方法对于金黄色葡萄球菌菌株分子分型有一定的借鉴意义, 也为金黄色葡萄球菌菌株分子流行病学调查奠定一定的基础.

金黄色葡萄球菌; 分离菌株; agr基因

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种革兰氏阳性细菌, 可引起人和动物的多种疾病. 金黄色葡萄球菌能够分泌多种毒素和酶, 这些毒力蛋白的表达是由RNA III调控, 它是agr(accessory gene regulator)位点转录的一个中心多向调节子, RNA III 目前认为至少是由两个双组份系统激活, 这两个双组份系统一个是由agr位点编码的AgrC与AgrA, 在金黄色葡萄菌中, 了解最清楚的双组分调节系统是AgrCA[1]; 另一个是RNA III激活蛋白靶点(TRAP)及RNA III激活蛋白(RAP).agr系统是一个群集感应系统, 在细菌从对数生长期到稳定期的过程中,它可以下调金黄色葡萄球菌的一些编码表面蛋白的基因转录, 同时可以上调一些胞外毒素的转录[2].agr位点包含两个反向的转录单元RNAII和RNAIII, 分别由P2和P3启动子控制, RNAII是多顺反子的转录单元, 包括AgrA、AgrB、AgrC、AgrD共4个开放阅读框(ORF), P2 操纵元编码一个双组份的信号转导系统(AgrC, 转膜受体组氨酸激酶; AgrA, 细胞质调控子), 一个前肽(AgrD), 和一个完整膜蛋白(AgrB)[3]. 在细菌生长的过程中, 成熟的自动诱导肽(AIP)累积在胞外环境中到达一个阈值浓度时, 就会通过磷酸化作用激活双组份系统AgrCA. 磷酸化的AgrA受到感应后, 上调启动子P2的转录, 经过扩大反应, 起始启动子P3的转录, P3转录体RNA III, 协调毒力因子分泌的上调, 同时下调表面蛋白[4]. Ji等[5]描述了特定的金黄色葡萄球菌产生的AIP能够激活它自己的agr位点,但可能会抑制其它菌株的agr表达. 这种现象的观察使得进一步发现不同菌株agr位点可变区呈现多态性, 这个可变区包含编码AgrD的核酸序列, AgrB的C末端的2/3序列, 以及AgrC的N末端的部分序列, 导致4个不同部分的相互干涉, 利用这一点可进行金黄色葡萄球菌分离菌株的分型研究[4]. 另外, RAP-TRAP是第二个双组份单元系统, 也显示能够激活RNA III的转录. 在细菌生长的初始阶段, RNA III激活蛋白RAP累积并诱导RNA III激活蛋白靶点TRAP的磷酸化, 结果上调agr位点产生RNA II, 前面也提及RNAII是多顺反子的转录单元, 一旦agr位点在生长的对数中期被激活, AIP和AgrC产生, AIP累积在环境中, 诱导AgrC的磷酸化, 导致AgrA的磷酸化, 上调RNA III合成, 下调TRAP磷酸化[6]. 可以看出, 金黄色葡萄球菌的大多数毒力因子是由agr位点调控, 基于agr编

码的自动诱导肽和相关受体的氨基酸序列多态性, 学者们把金黄色葡萄球菌agr分成4个主要组别(I-IV)[7]. 因此,本研究我们利用多重PCR技术, 初步探索agr I-IV基因型在不同来源的金黄色葡萄球菌临床分离菌株的分子流行状况, 为金黄色葡萄球菌菌株流行特征调查和菌株分型奠定一定的基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

人源金黄色葡萄球菌分离菌株8株; 牦牛源金黄色葡萄球菌分离菌株13株; 食品源金黄色葡萄球菌分离菌株104株; 鸡源金黄色葡萄球菌分离菌株28株; 羊源金黄色葡萄球菌分离菌株16株(由本实验室已鉴定和保存).

1.1.2 试剂

酵母提取物, 胰化蛋白胨, 购自OXOID英国; 琼脂糖(Agarose G-10)购自Biowest 香港; PCR扩增试剂(Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、10×PCR buffer)、100～2000 bp DNA Ladder Marker、RNase(1 mg/ml)、溶菌酶(20 mg/ml)、蛋白酶K(10 mg/ml)、6×上样buffer: 大连宝生物工程有限公司; 琼脂粉、NaCl、无水乙醇、EDTA、SDS、苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠, 购自成都市科龙化工试剂厂

1.1.3 仪器

Centrifuge 5417R冷冻离心机, Eppendorf; YN100P制冰机, 因纽特; DYY-6C型电泳仪, 北京六一仪器厂; TSNENEN031445PCR仪, BIO-RAD美国; MLS-3020高压蒸汽灭菌锅, SANYO日本; SW-CJ-1F超净工作台, 苏净集团安泰公司; XW-80A涡旋仪(Vortex): 上海青浦泸西仪器厂; Gel Doc XR S.N76S/03894凝胶成像仪, BIO-RAD 美国; SmartSpecTM plus, BIO-RAD 美国; HH数显恒温水浴锅, 金坛市金城国胜实验仪器有限公司; DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱, 上海一恒科技有限公司; GHP-9270隔水式恒温培养箱, 上海齐欣科学仪器有限公司; HZQ-F160振荡培养箱, 中国哈尔等滨：川市西东獐联牙电菜子多技

糖的术提开取发及有含限量公测定司; AKHL-Ⅲ-24型艾科(台湾)超纯水系统, 成都康宁实验专用纯水设备厂

1.2 方法

1.2.1 细菌培养方法

所有金黄色葡萄球菌株均分别在平板上划线分离, 挑取单菌落, 接种于5毫升LB液体培养基中, 37℃摇振(180 r/m)过夜培养(16小时), 用于DNA的制备.

1.2.2 模板DNA的提取

金黄色葡萄球菌分离菌株的DNA提取采用文献[8]的方法进行.

1.2.3 引物设计

根据agr等位基因 (I-IV)四种类型, 引物合成参考文献[7]. 引物序列及扩增产物大小详见表1.

表1 引物序列及目的产物大小Table 1 The primer sequence used in this study and the product size

1.2.4 多重PCR扩增条件

多重PCR扩增体系详见表2, PCR扩增条件如下: 95℃ 5min; 95℃ 40s、58℃ 50s、72℃ 50s进行35 个循环; 72℃ 延伸 10min, 4℃保存. 扩增完毕取扩增后的产物8μL进行琼脂糖凝胶电脉(1.5%), 80V, 40min, 凝胶成像系统照相, 观察扩增条带, 比较电泳图象.

表2 多重PCR扩增体系(20μL)Table 2 The multiple PCR system used in this study

2 结果与分析

利用四对引物分别对169株不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株提取的DNA进行多重PCR扩增, 根据多重PCR检测结果进行统计, 统计结果见表3, 其中66株分离菌株能够采用agrI-IV基因进行分型, 103株菌株不能采用该方法进行分型, 总agr基因检出率为39%(66/169); 其中, 人源金黄色葡萄球菌有6株菌株为agrⅡ型, 1株菌株为agrⅣ型, 1株菌株未能分型. 牦牛源金黄色葡萄球菌有6株菌株为agrⅡ型, 2株菌株为agrⅣ型, 5株菌株未能分型. 食品源金黄色葡萄球菌有1株为agrⅡ型, 20株菌株为agrⅢ型, 11株菌株为agrⅣ型, 72株菌株未能分型. 鸡源金黄色葡萄球菌有5株菌株为agrⅡ型, 23株菌株未能分型. 羊源金黄色葡萄球菌有14株菌株为agrⅡ型, 2株菌株未能分型. 五种不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株中均有检出agrⅡ型, 均未检出有agrⅠ型,agrⅡ型的检出率为19%(32/169),agrⅢ型检出率为12%(20/169),agrⅣ型检出率为8%(14/169). 由表4可以看出不同来源的分离菌株的检测率具有很大的差异性. 人源和羊源分离菌株采用agr基因分型率较高可达到87.5%,牦牛源次之达到61.5%, 而食品源和鸡源分离菌株的分型率相对较低, 分别各占30.8%和17.9%.

表3 不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株agr基因型统计结果Table 3 The detection results of agr I-IV in S. aureus isolates from different sources

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表4 不同来源的分离菌株agr基因分型检出率Table 4 The detection ratio of agr I-IV in S. aureus isolates from different sources

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种重要的机会致病菌, 能够引起人和动物的多种疾病, 如心内膜炎、骨髓炎、关节炎和奶牛乳房炎等, 它也是社区和医院感染疾病中发病率和死亡率最高的病原菌[9]. 金黄色葡萄球菌附属基因调节系统agr是最早发现的金黄色葡萄球菌调控位点[10], 同时也被认为是金黄色葡萄球菌最重要的群集感应系统,它影响着许多外毒素和胞外蛋白的分泌表达. 本研究利用agr基因位点序列的多态性对不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株进行agrI- IV分型研究初探, 结果表明不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株中agrII型流行性最高,紧接着是agrIII, 从我们的研究结果可以看出, 五种不同来源的所有分离菌株中都有agrII型出现. 我们的研究结果与其它研究具有一定的差异性[11], Khan等[11]在调查医院源的金黄色葡萄球菌分离菌株时, 发现agr I的流行

性最高, 紧接着是agr III. 同样Xie等[7]的研究也表明108株医院源菌株分离菌株中, agr I 型占据最流行地位,所有的108株菌株中65株是agr I, 其次是agr III、agr II和agr IV. 我们的研究也发现agr III的流行占据次之位臵, 这一点与其它的研究具有一致性. Khan等[11]和Xie等[7]的研究都是针对医院源的分离菌株, 而我们的研究扩大了范围, 本文针对人源, 牦牛源, 食品源, 鸡源和羊源金黄色葡萄球菌分离菌株进行agrI-IV基因型的初探,结果同样具有一定的借鉴意义, 从我们的研究结果可以看出不同来源的菌株之间存在一定的差异性. 另外, 我们的研究结果也发现, 存在大量的菌株不能采用I- IV基因型方法进行分类, 这一点在其它文献研究中也提及到[7,11],未能分型的菌株说明agr阴性的金黄色葡萄球菌菌株大量存在, 尽管agr基因在细菌的毒力调节上具有重要的影响. Paulander等[12]的研究指出15-60%的金黄色葡萄球菌临床分离菌株是agr缺陷性菌株, 他们的研究认为抗生素的过量使用是造成金黄色葡萄球菌大量菌株出现agr阴性的原因, agr的缺失与抗生素的使用和菌株的变异之间存在着直接的联系, 并且认为agr阴性的菌株比agr阳性的菌株对某些抗生素的亚致死浓度具有更好的适应性,这或许能够解释我们的样品中含有大量未分型金黄色葡萄球菌的原因, 也暗示了抗生素在我国养殖业中的大量使用. 我们未来的研究看能否关联agr阴性菌株与细菌的耐药之间的联系. 本文研究为金黄色葡萄球菌分离菌株的分子分型奠定一定基础, 同时也为进一步探讨金黄色葡萄球菌毒力因子奠定基础.

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Investigation of the agr I-IV groups in Staphylococcus aureus isolates from five different sources

WANG Qiong, TANG jun-ni, TANG Cheng, CHEN Juan, LIU Ji
(Schoolof Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:The accessory gene regulator (agr) locus inStaphylococcus aureusis a global regulator of quorum sensing and controls the production of many virulence factors. This study was carried out to investigate the agr I-IV groups in Staphylococcus aureus isolates from five different sources.Methods:According to agr allele types (I – IV) specific primers, multiplex PCR was used to amplify the extracted DNA of 169 S.aureusisolates and to determine the agr groups.Results:The agr groups’ distribution in 169 S. aureus isolates was as follows: 19%(32/169) belonged toagrⅡ, 12%(20/169) belonged to agr Ⅲ and 8%(14/169) belonged toagrⅣ. agr I was not detected in all the isolates. For 109 isolates, the agr group was not detected. This study shows that different agr I-IV groups prevail over our area and agr typing has some significance to investigate the genotypic information of the S. aureus isolated strains.

Staphylococcus aureus; isolates; agr I-IV

R117

: A

: 1003-4271(2014)03-0354-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.06

2014-04-01

唐俊妮(1971-), 女, 汉族, 湖北枣阳人, 副研究员, 研究方向: 食品质量与安全, E-mail: junneytang@aliyun.com.