郭娇, 信金伟, 姬秋梅, 张成福, 柴志欣, 钟金城

(1. 西南民族大学动物遗传育种学国家民委/教育部重点实验室, 成都 610041; 2. 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所, 拉萨 850000)

基于mtDNA COⅠ基因的西藏牦牛遗传多样性及系统进化研究

郭娇1, 信金伟2, 姬秋梅2, 张成福2, 柴志欣1, 钟金城1

(1. 西南民族大学动物遗传育种学国家民委/教育部重点实验室, 成都 610041; 2. 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所, 拉萨 850000)

为从分子水平上探讨西藏牦牛的序列多态性、群体遗传多样性和系统进化关系, 本研究对17个西藏牦牛类群170个个体的mtDNA COⅠ全序列进行测序, 用MEGA5.0、DNASP5.0等软件分析核苷酸组成、单倍型多样性和核苷酸多样性. 基于Kimura-2-Parameter双参数模型, 分别采用邻近法(NJ)和最大似然法(UPGMA)构建系统进化树, 分析不同牦牛类群的亲缘关系和分类. 结果表明: ①西藏17个牦牛类群的mtDNA COⅠ全序列长度均为1 545 bp, 个体间无长度差异, 无内含子, 起始密码子为AUG(ATG), 终止密码子为UAA(TAA), 共编码514个氨基酸. T、C、A和G 4种碱基的平均含量分别为29.5%(29.3%～29.8%)、25.5%(25.2%～25.6%)、28.7%(28.6%～28.9%)和16.3%(16.2%～16.5%); A+T的平均含量为58.2%, 存在一定的碱基偏倚性. ②在17个西藏牦牛类群的170头牦牛中, 共发现mtDNA COⅠ有25种单倍型, 单倍型多样性值在0～0.978之间, 平均单倍型多样性和核苷酸多样性值分别为0.566、0.00326, 表明西藏牦牛具有较丰富的遗传多样性. ③西藏牦牛mtDNA COⅠ中亮氨酸平均含量最多(11.496%), 半胱氨酸平均含量最少(0.1946%).碱性氨基酸、酸性氨基酸的含量分别为6.6171%、4.8627%; 亲水性氨基酸、疏水性氨基酸分别为57.39%、42.61%. ④基于mtDNA COⅠ, 西藏17个牦牛类群可分为2大类, 即类乌齐(LWQ)牦牛单独成一类, 其它牦牛类群聚为一类.

西藏牦牛; mtDNA COⅠ; 遗传多样性

牦牛是食草性反刍家畜, 主要分布在以青藏高原为中心的高山和亚高山地区, 对高寒草地的极端气候条件具有较强的适应性, 并作为“全能”家畜为当地牧民提供必要的生产和生活资料. 目前, 中国牦牛数量约占全世界牦牛总数的95%左右, 主要分布于青海、西藏、四川、甘肃、新疆、云南、内蒙古等省. 20世纪90年代以来,越来越多具有代表性的DNA序列、功能基因和各种分子标记手段被用于牦牛遗传资源的研究, 涂正超[1]、钟金城[2]、肖玉萍[3]和廖信军[4]等分别采用RFLP、微卫星标记、AFLP以及微卫星荧光标记等技术对西藏牦牛的mtDNA、染色体和mtDNA D-loop区进行分析及分类研究. 目前, 限于地理、气候等客观因素的影响, 人们对西藏牦牛资源的研究相对较少, 缺乏系统完善的考证资料, 因此还有待于从历史演变、地理分布、群体迁移、其它分子标记及全基因组分析等方面进行更加深入的研究.

mtDNA由于具有进化速度快、母系遗传、结构简单、易于分析等特点, 作为分子遗传标记在分子系统学研究中应用甚广, 是研究动物地理分布和多态性的灵敏材料. COⅠ基因是全球性物种鉴别系统的通用序列. 与其它的基因片段相比, COⅠ基因有许多优点, 序列长度适中且既相对保守又具有足够变异. COⅠ基因在脊椎动物和无脊椎动物的系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化学研究中均得到广泛应用[5-8]. Gunilla等[9]利用线粒体COⅠ基因部分序列对北欧四节蜉种类界限进行研究, 促进了四节蜉分类群更深层次的研究. 本研究通过对西藏牦牛mtDNA COⅠ全序列测序及系统进化分析, 以期为西藏牦牛的遗传多样性和分类, 以及今后的保护和利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

样品采集于西藏自治区各区县, 从17个牦牛类群中, 选取健康成年牦牛各10头, 共170头(表1). 采集耳组织, 75%乙醇保存带回实验室, 于–80℃保存备用.

表1 试验牦牛类群、数量及采样地点Table 1 Test yak groups, number and sampling location

1.2 基因组DNA提取及检测

牦牛耳样基因组DNA的提取采用传统酚-氯仿抽提法, 用紫外分光光度计(eppordf)和1%(10g/L)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度, –70℃保存备用.

1.3 PCR扩增及测序

根据牦牛线粒体全基因序列(GenBank:AY684273.2)中mtDNACOⅠ基因的核苷酸序列, 用Primer5.0设计引物, F:5′- GTCTAATGCTTTGCTCAGC-3′, R: 5′-GAGGTTATGATGTTGGCTTG-3′, 引物由上海英骏生物技术有限公司合成.

PCR扩增体系为25ul; 其中上、下游引物各1uL(10 pmol·μL-1), 模板DNA 1uL(200～600 ng·μL-1), 2×Long Taq DNA预混酶12.5 μL(0.625 u), ddH2O 9.50 μL. PCR扩增程序: 94℃预变性5min; 30个循环(94℃ 45s、55.7℃ 30s、72℃ 1min); 72℃ 延伸10 min, 4℃保存. 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 胶回收试剂盒(OMEGA)纯化后进行测序.

1.4 分析方法及软件

用DNAMAN、SeqMan(DNASTAR Inc)等软件对mtDNACOⅠ序列进行校对拼接, 用ClustalX1.83软件进行比对分析, MEGA5.0软件统计碱基组成, 计算类群间遗传距离并基于Kimura-2-Parameter双参数模型, 分别采用邻近法(NJ)和非加权平均值法(UPGMA)构建系统进化树(图2), 使用DNASP5.0软件分析其遗传多样性.

2 结果与分析

2.1 西藏牦牛mtDNA COⅠ序列的核苷酸组成

经测序得到170头西藏牦牛 mtDNACOⅠ的全序列, 长度均为1 545 bp, 无内含子, 起始密码子为AUG(ATG), 终止密码子为TAA, 共编码514个氨基酸. T、C、A和G 4种核苷酸的平均比例分别为29.5%(29.3%～

29.8%)、25.5%(25.2%～25.6%)、28.7%(28.6%～28.9%)和16.3%(16.2%～16.5%); A+T的平均含量为58.2%, 显著高于G+C平均含量为41.8%. 表明17个类群的170头牦牛的mtDNACOⅠ基因均富含碱基A和T.

2.2 西藏牦牛mtDNA COⅠ的遗传多样性

根据西藏牦牛mtDNACOⅠ的核苷酸序列, 经分析共定义出25种单倍型, 平均单倍型数(H)、平均单倍型多样性(Hd)、平均核苷酸多样性(Pi)分别是3.647、0.566、0.00326(表2、3).

本研究所测序列与牦牛线粒体全基因序列(AY684273.2)中的mtDNA COⅠ的核苷酸序列比对分析, 发现不变位点1436个, 可变位点109个, 其中单态突变位点21个(位于4、6、7、8、10、27、37、38、40、41、42、43、44、46、472、475、672、787、1014、1101和1538碱基处)、简约信息位点88(位于18、19、20、21、45、69、72、138、204、213、219、252、264、273、276、282、294、297、327、333、363、423、441、471、534、543、546、549、570、583、588、594、604、618、627、628、648、666、684、688、693、717、741、742、750、765、771、774、813、822、825、847、867、879、882、921、924、951、960、970、972、1053、1062、1072、1077、1086、1107、1113、1128、1191、1206、1209、1218、1251、1266、1269、1329、1341、1357、1368、1380、1383、1395、1428、1446、1449、1459 和1533碱基处), 包含转换、颠倒2种核苷酸变异类型, 无插入或缺失. 其中转换91次(占81.25%), A↔G间的转换28次(占30.77%), C↔T间的转换 63次(占69.23%), 颠换21次(占18.75%), A↔C间颠换4次(占19.05%), A↔T间颠换 11次(占52.38%); G↔C间颠换3次(占14.28%), T↔G间颠换3次(占14.28%), 主要位于蛋白编码区(1～1545), 共7个保守区分别为73～137bp, 139～203bp, 364～422bp, 476～533bp, 973～1013bp, 1129～1190bp和270～1328bp, 序列保守度C为 0.929.

西藏17个牦牛类群的单倍型多样性变化范围在0～0.978之间(表2), 帕里牦牛的单倍型多样性最高为0.978,仲巴牦牛和桑桑牦牛的单倍型多样性最低为0; 核苷酸多样性变化范围在0～0.02382之间, 其中类乌齐牦牛最高为0.02382, 其次为帕里牦牛0.00401, 仲巴牦牛和桑桑牦牛最低为0. 单倍型多样性和核苷酸多样性值变化范围基本一致, 具有较强的相关性.

表2 西藏牦牛的单倍型多样性和核苷酸多样性Table 2 Haplotypes diversity and nucleotide diversity of domestic yaks in Tibetan region

表3 西藏牦牛mtDNA COⅠ的单倍型分布Table 3 mtDNA COⅠ gene haplotypes of 17 breeds of Tibetan yaks

2.3 西藏牦牛COⅠ的氨基酸组成

根据COⅠ基因序列推算COⅠ的氨基酸序列组成(表4). 结果表明, 在17个类群的牦牛中, COⅠ均含有20种氨基酸, 共由514个氨基酸组成, 其中天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)等13种氨基酸在类群间存在一定差异. 亮氨酸平均含量最多(11.476%), 半胱氨酸的平均含量最少(0.1946%). 碱性氨基酸、酸性氨基酸的含量分别为6.6171%、4.8627%; 亲水性氨基酸、疏水性氨基酸分别为57.39%、42.61%.

表4 西藏牦牛COⅠ的氨基酸组成Table 4 Average amino-acid composition of COⅠin Tibet Yak

2.4 西藏牦牛类群间的遗传距离及其分类

用MEGA5.0软件对西藏17个牦牛类群mtDNACOⅠ核苷酸序列进行分析, 得出类群间的遗传距离变化范

围在0～0.0176之间, 申扎牦牛与康布牦牛、丁青牦牛与日多牦牛间的遗传距离均最大(0.0176), 仲巴牦牛与桑桑牦牛间的遗传距离为0, 表明西藏牦牛类群间的遗传距离差异均较小, mtDNACOⅠ比较保守, 类群间差异不大(表5, 图1).

表5西藏牦牛类群间的kimura双参数遗传距离Table 5 Genetic distance between Tibetan yaks breeds inferred from kimura2-parameter

图1 基于kimura双参数遗传距离的西藏牦牛类群间的NJ聚类关系Figure 1 NJ tree based on Kimura 2-parameter distance between groups of Tibetan yak

图2 基于 Kimura 双参数距离的西藏牦牛类群间的 UPGMA 聚类关系Figure2 UPGMA tree based on Kimura 2-parameter distance between groups of Tibetan yak

3 讨论

3.1 西藏牦牛mtDNA COⅠ的遗传多样性

关于西藏牦牛mtDNA的研究中, 赵上娟等对111个西藏牦牛个体的COⅢ全序列进行测序得到其长度均为781bp, 无插入或缺失; 姬秋梅等对西藏牦牛mtDNAcytb的研究, 其全序列长度均为1140bp, 不存在长度多态性,张成福等根据114个西藏牦牛个体测得的D-loop区全序列长度在890到896bp之间, 包含4种碱基变异类型, 存在长度多态性. 海汀等研究150个西藏牦牛个体的ND5基因, 其全序列长度为1821-1823bp, 同样存在可能因插入或缺失引起的序列多态性. 以上研究结果显示, 线粒体基因组序列发生插入或缺失的可能性较低.

本研究中测得的170个西藏牦牛mtDNACOⅠ基因长度均为1545bp, 序列中的A+T的平均含量为58.2%, G+C平均含量为41.8%, 说明西藏牦牛mtDNACOⅠ存在着一定的碱基偏好性. 与赵上娟等对COⅢ基因(A+T含量为55.4%)、姬秋梅等[10]对cytb基因(A+T含量为58%)的A、T碱基偏好性基本一致.

丰富的遗传多样性对牦牛产业的持续发展起着至关重要的作用. 单倍型多样性(H)和核苷酸多样性(Pi)是从群体DNA水平上衡量遗传多样性的重要指标, H和 Pi 的值越大, 表明类群的遗传多样性越丰富. 本研究中170条序列中共发现109个变异位点, 有25种单倍型, 平均核苷酸多样性(Pi)为0.00326, 平均单倍型多样性(Hd)为0.566. 低于姬秋梅等[10]对西藏牦牛cytb基因的研究结果(Pi=0.003814, Hd=0.884), 但高于赵上娟等[11]对COⅢ基因(Pi=0.0018, Hd=0.3238)的研究结果, 说明西藏牦牛mtDNACOⅠ基因序列的核苷酸替代率高, 具有丰富的遗传多样性和单倍型多样性.

对西藏牦牛17个类群的Tajima's D值中的检测结果表明, 工布江达牦牛表现出显著(P<0.01), 其余的均为不

显著. 表明工布江达牦牛可能在某个历史时期由于自然环境或者人工选择而发生过群体扩张现象.

3.2 西藏牦牛群体的遗传分化

遗传分化指群体间遗传结构存在差异或遗传距离远近不同, 其主要影响因素有: 自然选择、人工选育、地理隔离和遗传漂变等. 生态环境的变化、群体迁移等使生物群体面临着优胜劣汰的自然选择, 生存压力使群体遗传结构发生了改变, 产生不同变异类型.

依据双参数遗传距离, 对西藏17个牦牛类群进行聚类分析, 根据NJ和UPGMA 聚类关系, 可将西藏地区的17个牦牛类群划分为两大类, 即类乌齐牦牛为一类, 其余牦牛类群为一类(图1, 图2). 研究发现西藏牦牛类群的划分和地理位臵并不呈现明显的相关性, 不能单一的通过区域分布来划分, 可能与牦牛的“单一起源有关”[12]. 西藏传统的三大优势牦牛类群为: 嘉黎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛. 本研究的分类结果和传统的这种划分有一定差异, 不完全一致. 在其他基于西藏牦牛基因的研究结果中, 姬秋梅基于mtDNA cytb基因将西藏牦牛划分为5大类: 巴青牦牛、嘉黎牦牛、工布江达牦牛、江达牦牛聚为一类, 帕里牦牛、康布牦牛、斯布牦牛聚为一类、类乌齐牦牛、丁青牦牛划分为一类, 桑桑牦牛和桑日牦牛为一类[10]; 张成福等根据mtDNAD-loop区全序列将康布牦牛和嘉黎牦牛分为一类, 其余划分为另一类; 柴志欣等[13-14]利用RAPD遗传标记将西藏牦牛分为2大类: 帕里牦牛为一类, 其余10个牦牛群体为一类; 郭松长等[15]对家牦牛mtDNA D-loop区研究中, 将斯布牦牛单独划分一类, 嘉黎牦牛和帕里牦牛在同一类. 本研究中类乌齐牦牛的遗传多样性最丰富, 这与钟金城等的研究结果基本一致. 以上分类结果之间有较多的不同, 这可能可能是由于自然或人工选择压力下, 不同DNA序列的进化速率存在一定差异造成的, 还有待于进一步的深入研究.

3.3 西藏牦牛遗传资源的保护与利用

总体上西藏牦牛遗传资源十分丰富, 牦牛是稀有的高海拔畜种, 能适应高原生态环境, 产乳、肉性能好, 繁殖能力强, 几乎没有发生过流行性疫病. 作者建议对西藏每个地区尤其是优势种的数量、性状指标(生长发育、产乳、产肉、繁殖性能、抗病力、适应性等)进行系统研究分析, 成立保护区, 进行保种选育, 并由专家对保种的效果进行监督、检测, 预防出现新的有害性状, 在保持遗传资源多样性不减少、不丢失的同时提高牦牛的生产性能, 适当的开展选育、杂交利用等工作. 合理的利用现有的牦牛品种资源, 达到开发利用与保护的双重目标.

4 结论

西藏牦牛具有较丰富的mtDNA COⅠ遗传多样性, 西藏17个牦牛类群可分为2大类, 即错那牦牛(CN)、仲巴牦牛(ZB)、嘉黎(JL)牦牛、斯布牦牛(SB)、江达牦牛(JD)、工布江达牦牛(GB)、丁青牦牛(DQ)、康布牦牛(KB)、日多牦牛(RD)、巴青牦牛(BQ)、桑日牦牛(SR)、聂荣牦牛(NR)、隆子牦牛(LZ)、帕里牦牛(PL)、申扎牦牛(SZ)、桑桑(SS)牦牛为一类, 类乌齐(LWQ)牦牛单独成一类.

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Evolution relationship and genetic diversity of Tibetan yaks inferred from mtDNA COⅠ

GUO Jiao1, XIN Jin-wei2, JI Qiu-mei2, ZHANG Cheng-fu2, CHAI Zhi-xin1, ZHONG Jin-cheng1
(1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Southwest University
for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Institute of Animal Science and Veterinary, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000, P.R.C.)

This paper investigated the genetic diversity, clustering relationships and genetic differentiation of Tibetan yak populations and fully sequenced on mtDNACOⅠof 170 units which came from 17 Tibetan yak populations. MEGA5.0, DNASP5.0 and other softwares were used to analyze the nucleotide components, haplotype diversities and nucleotide diversities. The Kimura-2-Parameter model was used, NJ and UPGMA phylogenetic tree was constructed to analyze the genetic diversities, phylogenies and classifications of different groups of yak.①The total sequences of the mtDNACOⅠcoming form 17 Tibet yak groups were 1 545 bp in length, with no gene intron. And the initiation codon was AUG (ATG), and the finial codon was TAA, which encoded 514 amino acids. The average ratios of 4 kinds (T, C, A ,G ) of nucleotides were respectively 29.5%(29.3%～29.8%), 25.5%(25.2%～25.6%), 28.7%(28.6%～28.9% and 16.3%(16.2%～16.5%); the average content of G+C was 41.8% and the average content of A+T was 58.2% as well, with an obvious base bias.② The mtDNACOⅠof the 17 Tibetan yak groups had a total number of 25 haplotypes, and the haplotype diversity values changed between in 0～0.978, while the average haplotype diversity and the nucleotide diversity values were 0.566 and 0.00326, showing that the Tibetan yak genetic diversities are so rich .③ The average content of leucine in the Tibet yak cytochrome C oxidase subunit Ⅰ was most of all(11.496%), the least average content was cysteine (0.1946%). Contents of basic amino acids, acidic amino acids were respectively 6.6171%, 4.8627%. Hydrophilic amino acid, hydrophobic amino acids were respectively 57.39%, 42.61%.④ The clustering relationship and analysis of molecular variance also suggested that Tibetan yak could be divided into two species．

Tibetan yak; mtDNACOⅠ; genetic diversity

S813; S823

: A

: 1003-4271(2014)03-0336-08

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.03

2014-04-02

钟金城(1963-), 男, 哈尼族, 云南绿春人, 教授, 博士, 研究方向: 动物遗传学, E-mail: zhongjincheng518@126.com.

国家科技支撑计划课题资助(编号: 2012BAD03B02)