胡金燕，郑 华，张雯雯，李 坤，刘兰香，张 弘

（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局特色森林资源工程技术研究中心，云南 昆明 650224）

胭脂虫红色素来源于胭脂虫雌成虫干体[1]，主要成分是胭脂虫红酸，是常用的优质天然染色剂[2]。它具有优良的着色性能和较强的自由基清除能力[3-4]，被广泛地应用在食品、医药品等行业中[5]。然而，胭脂虫红色素在物化特性上也有不足，脂溶性差限制了它在肉类及乳制品、油性化妆品等领域中的应用。目前，国内外有关胭脂虫红色素的研究报道主要集中在高效提取[6-9]、精制纯化[10-11]、分析测定[12-13]、应用[14-18]等方面，尚未有解决胭脂虫红色素在油脂类物质中溶解性问题的系统性报道。因此，采用化学方法对胭脂虫红酸的分子结构进行修饰以改善胭脂虫红色素的脂溶性，对其开发和利用有着重要的意义。每个胭脂虫红酸分子内含有8 个羟基和1 个羧基[16]，本实验采用月桂酰氯为改性试剂，与胭脂虫红酸分子上的羟基进行反应，生成胭脂虫红酸月桂酸酯，并引入亲脂性的长链烷基，既可保持胭脂虫红色素良好的着色性能，又可增加其脂溶性[19-20]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胭脂虫红色素由中国林业科学研究院资源昆虫研究所自制；玉米油 嘉里粮油有限公司；月桂酰氯 阿拉丁试剂（上海）有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethyllformamide，DMF）、乙酸乙酯、无水硫酸钠天津市风船化学试剂科技有限公司；正己烷 西陇化工股份有限公司；氯化钠 广东光华科技股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AB204-型精密型电子天平、HR83-P型快速卤素水分测定仪 梅特勒-托利多（中国）有限公司；TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克光谱仪器有限公司；N1000 Rotavapor RⅡ型旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；101A-2型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器有限公司；DU800型紫外-可见分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司；SPB-3型全自动空气源、GCN-1000型氮气发生器 北京中惠分析技术研究所；ACMAGHS-7型磁力搅拌器 广州仪科实验室技术有限公司；TY742X2A型纯水机 美国Barnstead公司。

1.3 方法

1.3.1 脂溶性胭脂虫红色素的制备

将1 g胭脂虫红色素加入三颈烧瓶中，使其溶解于DMF中。通入干燥的N220 min，然后在保温搅拌的条件下，将一定量的月桂酰氯通过滴液漏斗于10 min内滴加入三颈烧瓶中。恒温反应数小时后，将反应混合物过滤，向滤液中加入冰水，使未反应的月桂酰氯生成月桂酸，继续向混合液中加入正己烷萃取以洗去月桂酸。最后用乙酸乙酯反复多次萃取混合液，合并乙酸乙酯层并用饱和食盐水将其洗至澄清，经无水硫酸钠干燥后减压蒸出乙酸乙酯，风干可得到紫红色固体产物即脂溶性胭脂虫红色素。

1.3.2 制备脂溶性胭脂虫红色素的单因素及其优化验证

每次称取胭脂虫红色素质量m1为1 g，精确到0.000 1 g，在反应时间分别为0.1、1、2、3、5 h，月桂酰氯与胭脂虫红色素质量比（mL/mC）分别为1.90∶1、2.85∶1、3.80∶1、4.75∶1、5.70∶1，反应温度分别为0、20、40、60、80 ℃，DMF用量分别为5、10、15、20、25 mL的条件下，每次保持其中3 个量不变，改变另外一个量，经恒温非水相反应后分离提纯得到脂溶性胭脂虫红色素，干燥至恒质量称其质量m2。化学修饰前后胭脂虫红色素中除显色的主要成分外，还有部分杂质，为了更准确地得到修饰后胭脂虫红色素有效显色成分的量，运用公式（1）[21-22]计算胭脂虫红色素的回收率H。

式中：H为胭脂虫红色素的回收率/%；E1为修饰前胭脂虫红色素的色价；m1为修饰前胭脂虫红色素的质量；E2为修饰后脂溶性胭脂虫红色素的色价；m2为修饰后脂溶性胭脂虫红色素的质量。

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.5软件，采用Box-Behnken设计，分别以mL/mC、DMF用量、温度3 个因素为响应变量，以胭脂虫红色素的回收率作为响应值进行优化。

在最佳参数的圆整条件下，进行3 组平行实验，取平均值，与响应面优化预测值进行比较。

1.3.3 胭脂虫红色素和脂溶性胭脂虫红色素的图谱表征

红外光谱测试在傅里叶变换红外光谱仪上完成，傅里叶变换红外光谱（Fourier transfer infrared spectrum，FTIR）扫描范围4 000～400 cm－1，分辨率为4 cm－1。实验时分别取胭脂虫红色素和脂溶性胭脂虫红色素粉末与KBr混合，研磨均匀后压片，根据所得图谱对比两者典型官能团的特征吸收峰，从而判断胭脂虫红色素在改性前后是否在结构上发生了变化。

紫外-可见光谱测试在DU800型紫外-可见分光光度计上完成，UV扫描范围200～800 nm。实验时分别配制一定质量浓度的月桂酸溶液、胭脂虫红色素溶液及其脂溶性胭脂虫红色素溶液，于紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，根据特征吸收峰的位置判断胭脂虫红色素在改性后是否在结构上发生变化。

1.3.4 脂溶性胭脂虫红色素的溶解性测试

在2 个50 mL的锥形瓶中，分别加入食用玉米油20 g、去离子水20 mL，定量添加胭脂虫红色素，于室温20 ℃的条件下搅拌1 h，直至其不再溶解为止，计算其溶解度。采用同样的方法测试脂溶性胭脂虫红色素的溶解度。

将一定量的脂溶性胭脂虫红色素溶解于食用玉米油中，同时做空白对照样，定期用紫外-可见分光光度计于496 nm波长处测吸光度，运用公式（2）计算其保存率，判断溶解在食用玉米油中的稳定性[23-24]。

式中：A为脂溶性胭脂虫红色素在食用玉米油中的保存率/%；A初为最初加入脂溶性胭脂虫红色素后油样的吸光度；A末为加入脂溶性胭脂虫红色素一段时间后油样的吸光度。

2 结果与分析

2.1 制备脂溶性胭脂虫红色素的单因素试验

2.1.1 反应时长对胭脂虫红色素回收率的影响

图1 反应时长对胭脂虫红色素回收率的影响Fig.1 Effect of reaction times on the recovery of cochineal dye

由图1可以看出，胭脂虫红色素的回收率随着反应时长的增加呈现一个比较平缓的趋势，推断是由于月桂酰氯比较活泼，反应在很短时间内即可完成。当反应时长达到1 h时，胭脂虫红色素的回收率最高，可达36.18%，故可选1 h作为反应时长。

2.1.2 月桂酰氯与胭脂虫红色素质量比（mL/mC）对胭脂虫红色素回收率的影响

图2 月桂酰氯与胭脂虫红色素质量比对胭脂虫红色素回收率的影响Fig.2 Effect of mass ratio of lauroyl chloride to cochineal acid on the recovery of cochineal dye

由图2可知，随着月桂酰氯质量比的增加，胭脂虫红色素的回收率呈现先升高后降低的趋势，当mL/mC达到3.80∶1时，胭脂虫红色素的回收率最高可达52.57%。月桂酰氯加入量的适当增加可以提高胭脂虫红酸分子和月桂酰氯有效碰撞的机率，使得胭脂虫红色素更充分地反应；但是月桂酰氯加入量过大时，可能会伴随一些副反应的发生致使目标产物胭脂虫红酸月桂酸酯色价降低，从而造成胭脂虫红色素回收率的降低。所以选择mL/mC3.80∶1为中心点，以2.85∶1～4.75∶1为响应面优化区间。

2.1.3 反应温度对胭脂虫红色素回收率的影响

图3 温度对胭脂虫红色素回收率的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the recovery of cochineal dye

由图3可以看出，随着温度的升高，胭脂虫红色素的回收率呈现先增大后减小的趋势，当温度达到60 ℃时，胭脂虫红色素的回收率最高可达58.05%。在增大趋势中，温度对目标产物脂溶性胭脂虫红色素的生成起主导作用可能是由于温度适当的升高可以增加反应物的活性，反应较易进行；而温度过高可能会引起月桂酰氯的分解致使目标产物胭脂虫红酸月桂酸酯质量降低，从而造成胭脂虫红色素回收率的降低。所以选择温度60 ℃为中心点，以40～80 ℃为响应面优化区间。

2.1.4 DMF用量对胭脂虫红色素回收率的影响

图4 DMF用量对胭脂虫红色素回收率的影响Fig.4 Effect of DMF amount on the recovery of cochineal dye

由图4可知，随着DMF用量的增加，胭脂虫红色素的回收率呈现先升高后降低的趋势，当DMF用量达到20 mL时，胭脂虫红色素的回收率最高可达59.36%，在升高趋势中，DMF用量对目标产物脂溶性胭脂虫红色素的生成起主导作用，DMF用量的增加可以使得原料溶解较为充分，胭脂虫红酸分子和月桂酰氯分子可以更好地接触，反应更完全。在降低趋势中，随着DMF用量的增加，单位体积内原料浓度相应降低，从而造成胭脂虫红色素回收率的降低。所以选择DMF用量20 mL为中心点，以15～25 mL为响应面优化区间。

由以上单因素结果可以得出，mL/mC、温度、DMF用量的优化区间如表1所示。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2.2 响应面分析

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and results

表2是在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.5软件，采用Box-Behnken设计，选择mL/mC、温度、DMF用量3 个因素为变量，胭脂虫红色素的回收率为响应值进行优化。对所得的数据进行多元回归拟合，得到的二次多项回归方程如下：

胭脂虫红色素回收率的回归方程方差分析见表3。

表3 胭脂虫红色素的回收率回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the recovery of cochineal dye

由表3可以看出，该模型的P=0.001 6，失拟项的值为P=0.056 3，差异性不显著，则该模型的拟合度良好，且回归模型的拟合系数为0.976 0，说明胭脂虫红色素的回收率模型与之间的拟合度较好，具有较高的可靠性，很好地反映了mL/mC、温度、DMF用量和胭脂虫红色素回收率之间的关系，可用于分析和预测胭脂虫红色素的脂溶化改性工艺及回收率。所有交互项的P＞0.05，说明它们对胭脂虫红色素的回收率影响不显著；一次项B、二次项B2的P＞0.05，说明温度对胭脂虫红色素回收率的影响不显著；一次项A、C和二次项A2、C2的P＜0.05，说明mL/mC和DMF用量对胭脂虫红色素回收率均有显著的影响。

模型的响应面及其等高线图见图5。

图5 两个因素交互作用影响胭脂虫红色素回收率的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of reaction conditions on the recovery of cochineal dye

由图5可知，温度、DMF用量、mL/mC3 个因素对胭脂虫红色素回收率均有不同程度的影响。从图5a可以看出，mL/mC对胭脂虫红色素回收率的影响程度要大于温度；从图5b可以得出，mL/mC对胭脂虫红色素回收率的影响程度要大于溶剂用量；从图5c可以看出，DMF用量对胭脂虫红色素回收率的影响效果要大于温度。各个因素对胭脂虫红色素回收率的影响结果为：mL/mC＞DMF用量＞温度。

2.3 验证实验

在Design-Expert 8.0.5优化下，制备脂溶性胭脂虫红色素的最佳条件为：DMF、月桂酰氯、胭脂虫红色素的用量分别为15.27 mL、4.45 g、1.0 g；反应温度41.72 ℃；反应时长1 h。在上述最佳组合条件下胭脂虫红色素回收率的预测值为59.84%。为检验模型的合理性，在DMF、月桂酰氯、胭脂虫红色素的用量分别为15.3 mL、4.5 g、1.0 g；反应温度42.0 ℃；反应时长1 h的条件下进行3 组平行，测得胭脂虫红色素回收率的平均值为59.35%，偏差为0.008 2，说明该方程与实际情况拟合较好，证明响应面法优化的最佳工艺条件是合理的。

2.4 胭脂虫红色素和脂溶性胭脂虫红色素的图谱表征

从图6可以看出，胭脂虫红色素在3 300 cm－1左右有一宽而强的振动吸收峰，是形成氢键缔合的—OH伸缩振动吸收峰[25]。相较胭脂虫红色素的红外谱图，脂溶性胭脂虫红色素在3 300 cm－1左右的伸缩振动吸收峰明显变窄，说明引入的基团破坏了分子中的氢键，表明胭脂虫红色素改性产物的分子结构中的羟基或者羧基减少；脂溶性胭脂虫红色素在1 728 cm－1左右有特征吸收，可能是酯基中的C＝O（非共轭脂肪酸酯）引起的伸缩振动吸收[26]，可以初步判断月桂酰氯和胭脂虫红酸发生了酯化反应，并以酯基的形式和胭脂虫红酸分子中的羟基相连；脂溶性胭脂虫红色素在1 251 cm－1左右有特征吸收，可能是酯基团的—C—O—C—引起的伸缩振动吸收[27]。判断酯基存在的主要特征吸收是C＝O和—C—O—C—，因此可以初步判断胭脂虫红酸经反应后分子中出现了酯基，说明胭脂虫红酸已经被酯化[27]；脂溶性胭脂虫红色素在2 850～2 950 cm－1范围内可观察到明显的伸缩振动，2 925 cm－1左右为—CH3基团中的C—H伸缩振动吸收峰[28-29]，2 856 cm－1为—CH2基团中的C—H伸缩振动吸收峰[30]，表明胭脂虫红酸分子结构中引入了长碳链烷基，生成了胭脂虫红酸月桂酸酯。

图6 胭脂虫红色素和脂溶性胭脂虫红色素的红外谱图Fig.6 FTIR spectra of cochineal dye and liposoluble cochineal dye

图7 胭脂虫红色素、脂溶性胭脂虫红色素和月桂酸的紫外光谱图Fig.7 UV-Vis spectra of cochineal dye, liposoluble cochineal dye and lauric acid

由图7可以看出，月桂酸在207 nm波长处有特征吸收峰，胭脂虫红色素在276、325、496 nm波长处有特征吸收峰，脂溶性胭脂虫红色素在204、273、310、496 nm波长处均有特征吸收峰。对比胭脂虫红色素和脂溶性胭脂虫红色素的紫外-可见光谱，两者均在496 nm波长处均有特征吸收峰，是由于胭脂虫红色素的发色团为蒽醌环，蒽醌环并未发生反应，胭脂虫红色素在325 nm波长处有特征吸收，而脂溶性胭脂虫红色素在310 nm波长处有特征吸收，可能是由于胭脂虫红色素经改性后其分子中形成了酯键C＝O，且C＝O为n→π*跃迁，紫外吸收会产生蓝移，使得特征吸收峰向短波长方向移动。对比月桂酸和脂溶性胭脂虫红色素的紫外光谱，月桂酸在207 nm波长处有特征吸收峰，脂溶性胭脂虫红色素在204 nm波长处也有特征吸收峰，二者比较接近。从紫外光谱特性可以判定胭脂虫红色素与月桂酰氯发生了酯化反应，与文献[28-29]报道相吻合。

2.5 脂溶性胭脂虫红色素的溶解性测试结果

表4 胭脂虫红色素及其改性产物在油相和水相中的溶解度（20 ℃）Table 4 Solubility of cochineal dye and its modified product in edible corn oil and water

由表4可以看出，胭脂虫红色素在改性前后于室温20 ℃条件下在食用玉米油中的溶解度从0提高到了15.06 g/100 g，在去离子水中的溶解度降低，说明改性后的胭脂虫红色素有较好的脂溶性，可能是由于胭脂虫红酸分子的部分羟基被酯化后，分子间氢键作用减弱，同时引入长链烷基，有利于油脂的渗透和溶解。

表5 脂溶性胭脂虫红色素溶解在食用玉米油中的稳定性Table 5 tability of liposoluble cochineal dye in edible corn oil

由表5可以看出，经120 d的追踪观察后，脂溶性胭脂虫红色素在食用玉米油中保存率可达95%以上，稳定性较好。

图8 未添加（A）和添加脂溶性胭脂虫红色素（B）的食用玉米油图Fig.8 Photos of edible corn oil with (right) and without (left) added liposoluble cochineal dye

由图8可以看出，未加脂溶性胭脂虫红色素的食用玉米油呈黄色（图8A）；添加脂溶性胭脂虫红色素的食用玉米油呈红色（图8B），说明脂溶性胭脂虫红色素在食用玉米油中具有较佳的着色能力，且溶解性较好。经过120 d的追踪观察，油样清亮、透明度良好，无混浊或者沉淀产生，说明脂溶性胭脂虫红色素溶解在食用玉米油中的稳定性良好，具有开发和应用前景。

3 结 论

3.1 制备脂溶性胭脂虫红色素的最佳工艺参数为：D M F、月桂酰氯、胭脂虫红色素的用量分别为15.27 mL、4.45 g、1.00 g；最佳反应温度41.72 ℃；最佳反应时长1 h。在此条件下，胭脂虫红色素回收率的预测值为59.84%。在DMF、月桂酰氯、胭脂虫红色素的用量分别为15.3 mL、4.5 g、1.0 g；反应温度42.0 ℃；反应时长1 h的圆整条件下进行3 组平行实验，测得胭脂虫红色素的回收率为59.35%，偏差为0.008 2。在理论和实际数据的对比下，此模型具有一定的合理性，可用于实际预测。

3.2 通过比较胭脂虫红色素酯化修饰前后的红外、紫外-可见光谱图及性质变化，可以推断胭脂虫红色素和月桂酰氯发生了酯化反应，生成了胭脂虫红酸月桂酸酯，得到了脂溶性胭脂虫红色素。

3.3 脂溶性胭脂虫红色素在食用玉米油中的溶解度为15.06 g/100 g（20 ℃），并且稳定性较好，展现了在油脂类产品中良好的应用前景。

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