代 渊,胡 勇,巨少华,任香怡

(成都中医药大学,成都 611137)

阿霉素(Doxorubicin, Dox)作为一种重要的抗肿瘤药物，通过插入DNA螺旋、抑制拓扑异构酶II，并抑制DNA卷曲的剪切及共价联结，以抑制细胞修补、促进细胞凋亡，被临床广泛用于各种肿瘤的治疗，如乳腺癌与肺癌等[1]。同时研究表明，阿霉素也可产生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，如过氧化氢和超氧化物阴离子自由基等，通过这种方式也可诱导基于线粒体氧化损伤的肿瘤细胞死亡[2]。目前也认为，阿霉素的毒副作用也与这一氧化应激损伤有密切关系，如其引起的心肌肥大、充血性心力衰竭、心律不齐及骨髓抑制毒性等[3]，因此抗氧化剂的合并用药对缓解阿霉素的相关毒性具有重要作用。国内外也进行了大量的研究，如研究证实β-细辛醚[4]、木犀草苷[5]、黄芪苷Ⅳ[6]、金丝桃苷[7]均可减轻阿霉素的心肌毒性。

知母宁(Chinonin,Chi)又名芒果苷，属于多酚类化合物，来源于漆树科植物芒果树(Mangifera indica)、扁桃树(Mangifera persiciformis)的叶、果实和树皮、百合科知母(Anemarrhena asphodeloides)叶及龙胆科植物东北龙胆 (Gentiana manshurica)根茎等，被证实具有明确的抗氧化作用[8～11]，广泛应用于食品、化妆品、保健品。因此，应用知母宁对抗阿霉素所致心脏毒性的相关研究具有重要的应用与理论价值。早期研究确已证实，知母宁能对抗阿霉素体外引起大鼠心脏线粒体丙二醛(MDA)的生成、ATP酶的活性丧失及线粒膜流动性降低[10]，也能保护线粒体细胞色素C氧化酶的相关功能[11]，从而起到一定的解毒作用。但氧化应激仅为毒性启动的首发环节，其引起的炎症与凋亡通路活化是导致阿霉素最终心肌细胞损伤的直接病理诱因，相关研究目前未见报道。因此，本文观察了知母宁对阿霉素致乳鼠心肌细胞的保护作用，并观察了其对调控细胞凋亡的c-jun 氨基末端激酶(c-jun N terminal kinase, JNK)通路及其磷酸化水平、调控相关炎症介质表达的核转录因子κB (nuclear factor of kappa B, NF-κB)通路蛋白表达的影响，以探讨其相应的细胞保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生1～3 d的SD大鼠，由成都中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂

阿霉素为深圳万乐药业有限公司生产；知母宁购自成都曼彻斯生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；NF-κB p65、phospho-p65、JNK、phospho-JNK抗体购自Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗购自Santa Cruz公司。

1.3 实检主要仪器

BIORAD Mini-PROTEAN小型垂直电泳系统。

2 方法

2. 1 细胞培养

新生1～3 d的SD乳鼠心脏，经 0. 125% 胰蛋白酶分解消化4次，离心、洗涤后加入含 10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，差速贴壁法于 37℃、5% CO2孵箱中培养 2 h。将富含心肌细胞的培养液再次接种于含 10% 胎牛血清、1 μmol·L-1阿糖胞苷的高糖DMEM 中，细胞密度约为 5×105/L。24 h 换液去除阿糖胞苷，72 h 后细胞达融合状态，取生长状态佳者加干预药物，各组12只。

2.2 分组及给药

空白对照组加入含10% 胎牛血清的 DMEM 培养基； Dox模型组加入Dox(培养液配制Dox浓度为 2 mg·L-1); Dox+知母宁低、中、高剂量组(2、8、16 mg·L-1)。以上各组均于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

2.3 指标检测

MTT 检测细胞存活率 Dox损伤培养细胞 24 h，弃去上清液每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育 4 h，弃去上清加入DMSO 150 μL，振摇15 min。490 nm下检测各孔吸光度(A)，以下式(实验组吸光度/对照组吸光度) ×100%计算存活率。

Western blotting法检测 NF-κB和JNK磷酸化水平:各实验组心肌细胞给予不同的处理后，弃细胞培养液，用预冷的 PBS 洗 2 次，加入细胞裂解液冰上静置 30 min，收集细胞裂解液，12000 r/min 离心 30 min取上清，采用 BCA 法进行蛋白定量。取等量总蛋白经 SDS-PAGE 电泳后转移到 PVDF 膜上。用 5% 脱脂奶粉封闭 1.5 h，随后加入抗 p65(1∶1000)、 p-p65 抗体(1∶1000)、抗JNK (1∶400)和 p- JNK (1∶400)，4 ℃ 过夜，PVDF膜用 TBST 洗 3 次，10 min/次。与辣根过氧化物酶标记的第二抗体反应后，ECL 显色，暗室曝光到 X 线片上，Image J分析图像灰度值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 心肌细胞存活率

表1显示，与空白对照组比较，Dox损伤后心肌细胞存活数明显下降(P<0. 05)；与阿霉素处理组比较，知母宁高剂量组均能增加心肌细胞活力，并呈现一定的剂量依赖性，但差异无统计学意义。

组别例数心肌细胞存活率空白对照组120.6577±0.0211阿霉素处理组120.2543±0.0079阿霉素+低剂量知母宁组120.2687±0.0087阿霉素+中剂量知母宁组120.2797±0.0085阿霉素+高剂量知母宁组120.2982±0.0088

4.2 知母宁抑制 DOX 对心肌细胞磷酸化 NF-κB p65表达的上调作用

图1显示，2 mg·L-1DOX 处理后能显著增加p-p65的表达水平(P<0. 01)。与模型组比较，知母宁高剂量组可有效抑制p65磷酸化，使p65的磷酸化水平降低21.75%。而低、中剂量组虽有降低p65磷酸化的趋势，但无统计学意义。

图1 知母宁抑制阿霉素引起心肌细胞磷酸化NF-κB p65(p-p65)表达的上调作用注：与空白对照组比较:*P<0.05；与阿霉素处理组比较:#P<0.05

图2 知母宁抑制阿霉素引起心肌细胞磷酸化NF-κB p65(p-p65)表达的上调作用注：与空白对照组比较:*P<0.05；与阿霉素处理组比较:#P<0.05

4.3 知母宁抑制 DOX对心肌细胞磷酸化JNK表达的上调作用

图2显示，2 mg·L-1DOX 处理后能显著增加p-JNK的表达水平(P<0. 01)。与模型组比较，知母宁高剂量可有效抑制JNK磷酸化，使JNK的磷酸化水平降低12.96%。但低、中剂量组虽有降低JNK磷酸化的趋势，但无统计学意义。

5 讨论

阿霉素的心肌细胞毒性被认为与其产生的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)有密切关系[3]，抗氧化剂的应用一直是研究联合用药以降低阿霉素心脏毒性的重要方向。近年来大量的研究也证实，ROS引起的炎症反应及细胞凋亡过程在相关毒性产生中发挥着重要作用。因此，除对联合应用药物的抗氧化作用进行评价外，对其调控炎症或细胞凋亡关键通路相应靶位的研究也值得重视。

知母宁的抗氧化作用已得到较多的研究证实[8～11]。本研究进一步表明，知母宁具有一定的对抗Dox引起的心肌细胞损伤作用，但在所研究的剂量范围内疗效较弱。虽然已有研究证实这种心肌细胞保护作用可能与线粒体保护作用有关，但目前对知母宁调控细胞炎症与凋亡的相关反应报道较少。NF-κB具有调节与应激反应(包括炎症、氧化应激、凋亡等) 相关的基因作用，参与心肌炎症与坏死过程。NF-κB家族主要由5个亚单位构成，其中 p65是 NF-κB 发挥功能的必需亚单位。研究证明，Dox能明显上调 H9c2细胞 p-NF-κB p65 的表达水平，提示NF-κB 通路活化可能是 Dox引起心肌细胞炎症反应的机制之一[12]，本研究结果与其类似。本研究表明，高剂量组知母宁能显著抑制p65的磷酸化过程。

JNK是氧化应激所引起细胞凋亡信号通路最为重要的一环[13]。我们观察发现，Dox能明显增强JNK的磷酸化水平，这与已有报道一致[14]；但知母宁对其活化抑制作用虽具有一定的量效关系，但总体作用较弱。

综上所述，知母宁具有一定的抗阿霉素心肌毒性作用，其保护心肌细胞作用与抑制NF-κB和JNK通路的磷酸化水平具有一定的关联性。

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