项 云，屠平光，章啸君，楼芳芳，杜喜忠，胡旭进

(金华市农业科学研究院畜牧所，浙江 金华321000)

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术，成纤维细胞具有易培养，增殖快，形态和遗传性能稳定，可长期、完整、大量地保存生物体遗传信息的特点［1］。因此，通过构建家畜品种成纤维细胞库的途径保存或拯救其种质资源是目前最为理想的方法之一［2］。1997年，Wilmut 等用体细胞核移植转基因法获得世界上首例转基因克隆绵羊。转基因动物克隆以体细胞核移植技术作为基础，目前体细胞克隆转基因牛(Cibelli，1998)，山羊(Baguisi，1999)，猪(Polejaeva，2000;Lai，2002年)等相继获得成功［3］。而成纤维细胞是核移植中的一种理想供体细胞。

金华猪作为中国优良的地方猪种之一，在育种方面具有巨大的潜力。本试验研究了金华猪耳缘组织成纤维细胞的分离与原代、传代培养及生物学特性，获得了能在体外正常传代培养的细胞系，为动物克隆、转基因动物及其他细胞生物学研究提供细胞资源。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 DMEM(Dulbecco's Modium Essential Medium)培养液;胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS);青霉素、链霉素混合液(含青霉素10000 U/mL、链霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液;PBS 液等均为Hyclone 公司产品。Giemsa 染液(Giemsa stain)为Fluka 公司产品;完全培养液:含100U/ml 青霉素钠、100ug/ml 硫酸链霉素、10%FBS的DMEM 培养液;冻存液:含10%DMSO 和20%FBS 的DMEM 培养液;液氮罐YDS-30;倒置显微镜OLYMPASCKX41;二氧化碳培养箱Thermo311 型;超低温冰箱Thermo702 型。

1.2 试验方法

1.2.1 取材及处理 活体采集3 ～5日龄金华猪耳缘皮肤组织，用75%酒精充分清洗消毒，无菌条件下剪取大小为0.5 cm×0.5 cm 耳部皮肤，置于含双抗的PBS 液中，反复漂洗3 ～5 次，直到漂……