■杨建松王 露郭 宏马 鑫李 昆 王德培,3

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津牧丰饲料有限公司，天津300380；3.工业微生物教育部重点实验室，天津300457）

自20世纪50年代开始，在动物日粮中添加抗生素对畜牧业的发展做出了重大贡献[1]。然而抗生素应用带来的耐药性，药物残留以及土壤污染等问题迫使各国开始考虑禁抗的决定[2]。欧盟自2006年起全面禁止在畜禽饲料中添加抗生素[3]，我国在饲料中批准使用的抗生素种类也在逐渐减少[4]。人们开始寻求其他的替代品和替代技术，以保证畜牧业生产的效率与效益不受影响[5]。同时饲料资源短缺的问题长期制约着我国畜牧业的发展[6]，因此发展高效饲料工业，生产生态健康型饲料是当务之急。尤其仔猪的消化功能和胃肠道微生态系统尚不健全，通过生物发酵饲料代替抗生素添加饲料可以有效防治细菌性疾病，降低腹泻率，促进仔猪消化吸收，提高饲料利用率，从而使仔猪健康的生长。

微生物发酵能够产生有机酸，降低饲料的pH值，使得发酵饲料具有了酸香味，从而改善了饲料适口性，刺激了仔猪的采食量[7]。发酵可提高饲料中营养物质的消化率及利用率[8]，Canibe N等[9]研究表明，饲喂发酵饲料的猪只饲料报酬比饲喂干料饲料提高1.94%。发酵料中大量的益生菌会在肠道内定植，通过调节机体胃肠道微生态区系来抑制肠道中的致病菌[10]。无抗微生物发酵饲料还能对解决抗生素的滥用、残留和耐药性问题提供新的思路，为生产安全、无毒的无抗生素肉食品开辟一条经济的途径[11]。

本文以实验室筛选出的乳酸菌和芽孢杆菌作为发酵菌株，采用固体混菌厌氧发酵，通过单因素试验和正交试验对接种量、外加水量、多菌株的接种比例等发酵工艺进行分析和优化。通过对发酵工艺的改进，使各个菌种能够发挥优势，从而发酵生产能够在较低成本下得到适口性好，营养丰富，并且含有大量益生菌的生物活性饲料。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

枯草芽孢杆菌B10-5(Bacillus subtilis B10-5)、枯草芽孢杆菌WL-BA-1(Bacillus subtilis WL-BA-1)、豆粕乳杆菌（Lactobacillus soybean meal）、发酵乳杆菌TLa-6（Lactobacillus fermentum TLa-6），均由本实验室保藏。

1.2 培养基

肉汤培养基：牛肉膏5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l pH值7.2～7.4；固体培养基加琼脂粉20 g/l。

淀粉培养基：牛肉膏5 g/l、蛋白胨5 g/l、NaCl 5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，琼脂18 g/l，pH值7.2。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/l、酵母浸出粉5 g/l、NaCl 10 g/l，pH值7.2～7.5；固体培养基加15 g/l琼脂粉。

奶粉培养基：脱脂奶粉100 g/l、乳糖20 g/l，pH自然。

MRS培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、酵母浸出粉 5 g/l、葡萄糖 5 g/l、CH3COONa 5 g/l、柠檬酸二胺2 g/l、吐温80 1 g/l、K2HPO42 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、MnSO4·7H2O 0.05 g/l、CaCO320 g/l；固体培养基加琼脂粉20 g/l。

麦康凯琼脂培养基：蛋白胨20 g/l、乳糖10 g/l、牛胆盐5 g/l、NaCl 5 g/l、中性红0.03 g/l、琼脂18 g/l，pH值7.0。

1.3 饲料

试验所用饲料由天津牧丰饲料有限公司提供，经检测其还原糖含量为0.55%，酸溶蛋白含量为1.17%，乳酸、乳酸菌以及芽孢菌均检测不出。

1.4 培养方法

1.4.1 芽孢杆菌种子液制备

从LB培养基斜面挑取1环菌，接入到装有50 ml肉汤液体培养基的250 ml三角瓶中，放置于温度37℃、转速220 r/min的摇床中振荡培养14 h。

1.4.2 乳酸菌种子液制备

从奶粉培养基里吸取2 ml培养液，接入到装有100 ml MRS液体培养基的250 ml三角瓶中，放置于温度42℃的培养箱中静置培养14 h。

1.4.3 饲料固态发酵

将枯草芽孢杆菌B10-5、枯草芽孢杆菌WL-BA-1、豆粕乳杆菌、发酵乳杆菌TLa-6与一定量的水混合，然后与一定量的断奶仔猪全价料混匀，将其装入发酵瓶中37℃恒温培养。

1.5 测定方法

1.5.1 还原糖含量的测定

采用DNS法测定发酵饲料中还原糖的含量。

1.5.2 粗蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法测定发酵饲料中的总氮量。

1.5.3 酸溶蛋白质含量的测定

称取发酵饲料2.00 g，加入体积分数为15%的三氯乙酸溶液10 ml，混合均匀，静置5 min。将溶液定量转移，在4 000 r/min条件下离心10 min，取全部上清液，按凯氏定氮法测定上清液的可溶蛋白质[12]。

1.5.4 乳酸含量的测定

称取发酵饲料5.00 g置于装有50 ml蒸馏水的250 ml三角瓶里，浸提1 h，离心取上清液，然后用SBA-40E型生物传感分析仪测定其中乳酸的含量。

1.5.5 活菌数的测定

枯草芽孢杆菌用可溶性淀粉培养基作为计数培养基进行活菌计数；乳酸菌用MRS培养基作为计数培养基进行计数；大肠杆菌用麦康凯培养基作为计数培养基进行计数。

1.6 发酵条件的单因素优化

1.6.1 芽孢菌与乳酸菌比例的确定

选取芽孢菌与乳酸菌比例为1∶2；1∶1；2∶1；3∶1；4∶1这5个水平进行分析。

1.6.2 总接种量的确定

选取接种量为4%、6%、8%、10%、12%、14%这6个水平进行分析。

1.6.3 外加水量的确定

选取外加水量为43%、54%、67%、82%、100%、122%这6个水平进行分析。

1.6.4 发酵温度的确定

选取温度为20、28、34、37、42 ℃这5个水平进行分析，20、28℃发酵5 d，34、37℃和42℃发酵3 d。

1.7 发酵条件的正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响显著的因素进行正交试验。选用L9（33）型三水平三因素正交表，以接种量、芽孢菌与乳酸菌比例、外加水量3个因素作为考察因素，分析对发酵结果的影响。

2 结果与分析

2.1 仔猪发酵饲料芽孢菌与乳酸菌混合比例的优化(见表1）

表1 芽孢菌与乳酸菌混合比例对仔猪发酵饲料的影响

从表1可以看出，随着芽孢菌与乳酸菌混合比例改变，还原糖含量先升高后降低，而乳酸含量没有太大改变，当混合比例为3∶1时还原糖含量最高，所以确定仔猪发酵饲料中芽孢菌数与乳酸菌数比例为3∶1。

2.2 仔猪发酵饲料接种量的优化(见表2)

表2 接种量对仔猪发酵饲料的影响

从表2可以看出，随着接种量的增加，还原糖随之增加，不过接种量太高，在生产过程中所需要的菌液也会很高，这样会增加生产成本，而8%的接种量还原糖和乳酸含量也处于较高水平，所以最终确定接种量为8%。

2.3 仔猪发酵饲料外加水量的优化(见表3)

表3 外加水量对仔猪发酵饲料的影响

固态发酵的含水量是决定发酵成功与否的关键因素之一。含水量高容易导致基质多孔性降低，从而减少基质内气体；而含水量低会造成基质膨胀程度低，菌体生长受抑制。从表3可以看出，随着外加水量的增加，还原糖含量先增大后减少，54%时处于最大值，所以确定外加水量为54%。

2.4 仔猪发酵饲料温度的优化(见表4)

表4 温度对仔猪发酵饲料的影响

从表4不同发酵温度所得的还原糖和乳酸产生的结果可以看出，20℃和28℃较低温度下发酵5 d与较高温度42℃发酵3 d可以达到同样发酵效果。因为在实际规模生产中，严格控制固态发酵温度难以实现，一方面严格控制温度会增加成本，另一方面由于发酵过程中产生热量，导致物料堆积中心的温度与边缘的温度差异必然较大，所以通过以上数据可以得出在20～42℃均可以，但在实际生产中控制温度20～30℃作为发酵的温度。

2.5 发酵条件的正交试验

以单因素优化的发酵条件，采用L9（33）型三水平三因素正交试验研究接种量、芽孢菌与乳酸菌的比例、外加水量对发酵结果的影响，结果见表5。

表5 正交试验结果

以还原糖含量作为指标进行分析，如表6和表7所示。

表6 正交试验极差分析

由以上分析可以看出，影响因子的主次顺序为：接种量＞外加水量＞接种比例，即优化后的条件是接种量为8%，接种比例为3∶1，外加水量为59%。正交试验中第5组即是这个组合，其还原糖含量可达到1.78%，乳酸含量为3.3%，酸溶蛋白质含量为2.92%，芽孢菌数为5.6×105CFU/g，乳酸菌数为5.0×109CFU/g，并且有效的抑制了大肠杆菌，最终确定发酵条件。

表7 正交试验方差分析

3 结论

本文通过单因素试验和正交试验确定仔猪饲料的发酵工艺：接种量为8%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为3∶1，外加水量为59%，发酵温度范围为20～42℃。按此条件37℃下发酵72 h后还原糖含量增加了1.23%，是发酵前的3.24倍，酸溶蛋白质含量增加了1.75%，是发酵前的2.50倍，乳酸含量增加了3.3%，同时产生了大量益生菌，而且有效的抑制了大肠杆菌。