■刘旭辉 杨亚晋 蔡 军 商婷婷 张日俊

（1.中国农业大学动物科技学院动物营养国家重点实验室，北京100193；2.西南农林大学生命科学学院，云南昆明650224）

豆粕作为畜禽最重要的植物性蛋白源被广泛地 运用到饲料中。但由于豆粕中存在大豆球蛋白、β-大豆伴球蛋白和胰蛋白抑制因子等多种抗营养因子，其应用受到很大的限制[1-3]。豆粕经过微生物发酵，抗营养因子被降解至相当低的浓度，甚至被完全消除。大分子蛋白含量降低，水溶性蛋白、小肽和小分子蛋白含量得以提高，脲酶活性降低[4]，磷的有效含量提高[5-6]。同时，因生成了大量的益生菌、乳酸和未知生长因子等物质[7]，使其成为了一种优质的功能性蛋白原料[8]。

微生物发酵已成为一种消除豆粕中抗营养因子，提高豆粕营养价值的常用方法。但因为所采用豆粕原料品质的差异，发酵用菌种和发酵策略的不同，所得到的产品质量参差不齐。行业中没有通行的标准加以规范，缺少评价体系[3]。又因为技术不成熟，发酵成本相对较高，使得应用最为广泛的还是豆粕，而不是更为优良的发酵豆粕。发酵豆粕要被大家广泛地接受，其重点、突破点便是寻找更加优秀的菌种，更加高效地去除抗营养因子，更加高效地提高肽含量。本研究从提高肽含量这点出发，旨在通过自主设计的ND双层平板，结合豆粕发酵培养基，从生境中筛选适用于豆粕发酵的高产蛋白酶芽孢杆菌。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

豆豉和豆腐乳（购自超市）、健康猪禽肠道内容物、土壤。

1.1.2 培养基

营养琼脂：蛋白胨1%、NaCl 0.5%、牛肉浸膏0.3%、琼脂2%，pH值7.2，121℃灭菌20 min。

脱脂牛奶琼脂：脱脂奶粉5%、琼脂1%，115℃灭菌20 min。

芽孢种子培养基：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.02%、CaCl20.02%，pH值7.0，121℃灭菌20 min，下文中省略为“种子”。

ND双层平板：上层为营养琼脂，下层为脱脂牛奶。分别配制100 ml的营养琼脂和100 ml的脱脂牛奶琼脂，灭菌后，室温冷却至60℃左右时倒板。先倒脱脂牛奶10 ml于平板中，待冷却凝固后再倒入营养琼脂10 ml。

豆粕发酵培养基：豆粕（过60目）2%、葡萄糖1%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO40.03%、CaCl20.1%，pH值自然，121℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 初筛

样品于8.5%无菌生理盐水中均质后，80℃水浴10 min。10倍梯度稀释至一定倍数，取后三个梯度各100 μl，涂布于ND双层平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24 h，挑选周围有明显透明水解圈的菌落进行革兰氏染色、镜检。对初步选定的菌株划线纯化，并保种备用。

1.2.2 复筛

初筛得到的菌株接种于芽孢种子培养基，180 r/min、37℃培养18 h。活化后的菌种按2%接种量接种于豆粕发酵培养基，180 r/min、37℃培养48 h。取发酵液，4℃、10 000 r/min离心10 min。用Folin-酚法测定上清液蛋白酶活性，参照《GB/T 23527—2009蛋白酶制剂》附录B酶活力测定方法的福林法进行。

1.2.3 生长曲线

根据装液量（50 ml/250 ml、30 ml/100 ml）、培养基（豆粕发酵培养基、芽孢种子培养基）、接种菌龄（12、24 h）及保存方式（现培养、4℃保存）的不同，绘制生长曲线。试验分组及处理见表1，每隔2 h取样，适度稀释后用紫外分光光度计测定OD600nm。

表1 试验分组及处理

1.2.4 产酶曲线

按2%接种量将目标菌株接种于豆粕发酵培养基，37℃、180 r/min培养。每隔2 h取样，4℃、10 000 r/min离心，上清经缓冲液适度稀释后，测定蛋白酶活性。由此绘制得产酶曲线，以确定菌株的最高产酶量、最高产酶时间及产酶随时间的变化关系。

1.2.5 菌种鉴定

1.2.5.1 16S rDNA测序

提取目标菌株基因组作为模版，利用通用引物进行PCR扩增后测序。引物序列：上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下 游 引 物 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'；反应体系 50 μl：DNA模板1 μl，2×Taq PCR Mix 25 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，ddH2O 20 μl；扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化有限公司，引物合成及PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。测序结果经Blast在线比对后，运用ClustalX 2和MEGA 5.1构建系统发育树。

1.2.5.2 GyrA测序

提取目标菌株基因组作为模版，以GyrA特异性引物进行PCR扩增后测序。引物序列：上游引物5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'，下游引物 5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'；反应体系：50 μl：DNA模板1 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，ddH2O 20 μl；扩增条件：94 ℃预变性3 min，94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸75 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，测序由上海英骏生物技术有限公司完成。结果分析同16S rDNA测序。

1.3 统计分析

运用Excel对数据初步整理后采用SAS 9.0进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示。作图由Graphpad Prism 5完成。

2 试验结果

2.1 初筛结果

通过观察菌株生长在上层营养琼脂培养基表面的菌落形态、菌落周围的水解透明圈情况、革兰氏染色及镜检情况，初步确定7株产蛋白酶比较丰富的G+芽孢杆菌进入复筛。菌落在培养基上的生长及水解透明圈情况见图1。

图1 初筛结果，左图为背面拍摄的一块平板，右图为正面拍摄的一个菌落

2.2 复筛结果

将初筛得到的7株菌接种于豆粕发酵培养基，按1.2.2设计进行复筛。各菌株在豆粕发酵培养基中生长良好，培养48 h后测定发酵上清液中蛋白酶活性，测定结果见表2。从中筛选得到T1，它来自豆豉样品。

表2 复筛结果

2.3 T1的生长曲线

根据1.2.3设计，绘制T1在0～24 h时间段的生长曲线，见图2。从A、B、C、D曲线图形基本一致可以看出，不同的接种菌龄、装液量和本试验用到的两种不同的培养基对T1的生长没有明显的影响。生长曲线的前段存在明显差异的E组因接种的是4℃保存斜面培养基上的菌落，它需要更多的时间才进入对数生长期。

图2 T1的生长曲线

2.4 T1产蛋白酶的时间曲线

图3为接种T1产蛋白酶曲线，从中可以看出0～42 h上清液中蛋白酶活性逐渐升高，在42 h时达最高值，为1 683.99 U，而后趋于平缓甚至降低。

图3 T1产蛋白酶活曲线

2.5 菌种鉴定结果

16S rDNA鉴定结果：以T1的基因组为模版PCR扩增得到1 465 bp的特异性产物。经NCBI Blast比对，T1与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum strain M20J和Bacillus subtilis strain CICC10265的同源性最高，相似度都达99%，从而鉴定T1为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。由Clustal X2和MEGA 5.1构建的进化树见图4，树枝上的数字表示Bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。

图4 T1 16S rDNA鉴定结果

Gyrase A鉴定结果：以 T1的基因组为模版，通过Gyrase A部分序列扩增得到937 bp的PCR产物。经NCBI Blast比对，T1与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum YAU B9601-Y2和Bacillus amyloliquefaciens Y2同源性最高，这两株菌都属于解淀粉芽孢杆菌，由此鉴定得T1为解淀粉芽孢杆菌，结果见图5。

图5 T1 GyrA鉴定结果

3 讨论

3.1 高产蛋白酶芽孢杆菌的筛选

筛选产蛋白酶的微生物，大家普遍采用酪素平板[9-11]或脱脂牛奶平板[12]。试验中发现酪素平板上面的蛋白水解透明圈不明显，存放几天后甚至消失。脱脂牛奶平板营养不丰富，某些不能利用乳糖的细菌在其上几乎不生长；同时由于培养基表面过于湿润光滑，某些能利用乳糖作为碳源的细菌在上面生长时菌落扩散十分厉害，不利于观察。并且，以上两种培养基都不能够在筛菌的同时从菌落形态上对生长的菌株进行初步的判断。

熊涛等[13]在筛菌时用到双层平板，其下层为琼脂水，上层为一般性培养基，目的是要在平板内创造更加适合厌氧菌生长的厌氧环境。本试验从筛选产蛋白酶芽孢杆菌这一目的出发，创新采用ND双层板。菌落在上层营养琼脂表面正常生长，生长过程中产生的蛋白酶扩散至下层，水解下层的脱脂牛奶，形成透明圈。本方法在检查蛋白酶活性的同时可以对菌株形态学进行观察，对菌株种类做出初步的判定。同时还克服了脱脂牛奶平板对于细菌生长营养不全和酪素平板透明圈不明显的缺点。

3.2 T1产蛋白酶及生长情况

孙妍等[10]从纳豆中筛选得到一株纳豆芽孢杆菌NB1，发酵液中蛋白酶活性为19.41 U/ml。马桂珍等[12]从土壤中筛选得到一株地衣芽孢杆菌GD-2-2，酶活力为447.6 U/ml。王振华[11]从其实验室保存菌株中筛选出一株枯草芽孢杆菌，蛋白酶活为446.889 U。熊涛等[13]从豆制品中筛选得到一株枯草芽孢杆菌NCU646，厌氧条件下在豆粕固态发酵培养基中发酵96 h后蛋白酶活达9 600 U/g。本试验筛选得到的解淀粉芽孢杆菌T1在豆粕发酵培养基中培养42 h，上清液蛋白酶活性可达1 683.99 U。从生长曲线还能看出T1生长迅速，8～9 h便能达到稳定期，16 h后芽孢迅速增多，体现在曲线后段的再一次攀升。

3.3 T1的鉴定

枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌同属于枯草芽孢杆菌组的菌种，由于亲缘关系很近，序列间相似度很高，不能通过16S rDNA将他们有效地分开。有研究者发现，以编码蛋白的基因作为系统发育鉴定标记可以弥补这一缺陷，如DNA促旋酶A亚基编码基因GyrA[14]。本试验先通过16S rDNA测序，确定T1为枯草芽孢杆菌属，但不能区分开T1是枯草芽孢杆菌还是解淀粉芽孢杆菌。在此情况下，克隆了部分GyrA基因用于测序，并最终鉴定T1为解淀粉芽孢杆菌。

4 结论

①运用ND双层平板和豆粕发酵培养基从豆豉中筛选得到一株高产蛋白酶芽孢杆菌T1。它在豆粕发酵培养基中，37℃、180 r/min培养42 h，上清液蛋白酶活性可达1 683.99 U。

②通过16S rDNA和GyrA部分序列扩增测序，鉴定T1为解淀粉芽孢杆菌。