曹 珲

(南京市胸科医院 胸外科，南京 210029)

射干麻黄汤对哮喘大鼠气道重塑及TNF-α、IL-17的影响

曹 珲

(南京市胸科医院 胸外科，南京 210029)

目的 观察射干麻黄汤对哮喘大鼠模型气道重塑和TNF-α、IL-17的影响。方法 采用卵蛋白(OVA)联合雾化吸入的方法建立哮喘大鼠模型，50只SD大鼠随机分为5组。观察治疗后各组大鼠的TNF-α、IL-17含量以及大鼠气道壁厚度。结果 地塞米松组及中药组大鼠TNF-α(1.29±0.16,0.84±0.19)、IL-17(1.42±0.44，0.75±0.27)与模型空白组TNF-α(1.68±0.21)、IL-17(2.19±0.34)相比较明显降低(Plt;0.01),且中药组降低的幅度明显大于地塞米松组(Plt;0.05)；在气道壁厚度改善方面,中药组的疗效明显好于地塞米松组,差异对比具有统计学意义(Plt;0.05)。结论 射干麻黄汤可以有效抑制哮喘大鼠的TNF-α、IL-17质量浓度达到抑制炎症的目的,从而缓解哮喘大鼠气道重塑的进程。

喘证;气道重塑;TNF-α;IL-17;射干麻黄汤；大鼠

支气管哮喘是目前最常见的慢性肺系疾病之一，它是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎性细胞、结构细胞参与的气道慢性炎症疾病[1]，在哮喘发生的过程中不单单存在气道炎症，还会出现气道结构异常现象[2]。目前认为哮喘的发生是遗传、环境、免疫等多因素共同导致气管内壁的慢性炎症[3]，研究认为哮喘的发生主要是由于Th1/Th2之间的平衡状态被打破,从而引发一系列哮喘的临床症状[4-5]。由于炎症学说的确立，抗炎治疗得到了广泛的应用，但很多药物只是单纯的缓解症状，并不能有效逆转哮喘的发生，同时长期应用抗炎药物还会带来一系列的不良反应，因此研究人员开始关注中医药在哮喘治疗过程中的作用。我们研究发现,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-17(IL-17)在哮喘的发病及气道重塑过程中发挥促炎的作用，射干麻黄汤是治疗哮喘名方，本研究通过建立哮喘大鼠模型,观察射干麻黄汤对哮喘大鼠血清中TNF-α、IL-17的影响及对气道重塑的影响，探讨射干麻黄汤治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠50只，体质量(220±20) g，由南京中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物 射干麻黄汤组成:射干12 g，麻黄12 g，半夏12 g，紫菀9 g，款冬花9 g，细辛3 g，五味子3 g，生姜9 g，大枣3枚组成。所有中药由江苏省中医院药剂科提供,采用自动煎药机煎取，浓缩为1 mL含生药0.96 g(低剂量组)、3.84 g(高剂量组)2个组别；地塞米松针剂(5 mg/mL)，辰欣药业股份有限公司，国药准字H37021969；0.9% NaCl溶液，南京小营药业集团；水为重蒸馏高纯水。

1.3 实验试剂 卵蛋白(OVA)，美国Sigma公司;氢氧化铝，上海鑫贵源化工有限公司;大鼠TNF-α、IL-17酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

1.4 实验仪器 冰冻切片机，浙江省金华科迪仪器设备有限公司;RM2135型石蜡切片机,德国LEICA公司；XL型全自动染色机，德国；SZ-93自动双重纯水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂；MPIAS-500彩色病理图文分析系统；超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备公司。

1.5 动物分组 50只SD大鼠随机分为5组：正常组(A组)、模型空白组(B组)、地塞米松组(C组)、射干麻黄汤低剂量组(D组)、射干麻黄汤高剂量组(E组)。

1.6 动物模型制备 参照文献[6-7]采用卵清蛋白注射和雾化吸入的方法制备大鼠支气管哮喘模型。将1 mg OVA与200 mg氢氧化铝溶于生理盐水中，配成1 mL的混悬液。在实验的第1、7、14 d采用腹腔注射OVA混悬液0.1 mL致敏。从第15天开始用1%OVA的生理盐水雾化激发，隔日1次，每次30 min，共持续4周。当大鼠出现烦躁不安、呼吸加快、口唇紫绀、大小便失禁等症状，说明哮喘大鼠模型制备成功。第5周开始进行哮喘治疗，C组大鼠给予地塞米松1 mg/(kg·d)灌胃治疗，D组大鼠给予含生药量0.96 g/(kg·d)的射干麻黄汤灌胃治疗，E组大鼠予含生药量3.84 g/(kg·d)的射干麻黄汤灌胃，A组及B组给予生理盐水灌胃治疗，持续治疗20 d。

1.7 标本收集 在末次治疗24 h后，处死大鼠。抽取大鼠股动脉血液2 mL，离心20 min(3 000 r/min)，分离血清后置于-80 ℃保存。按照ELISA试剂盒说明书进行检测TNF-α、IL-17水平。处死大鼠后迅速取出左支气管置于福尔马林溶液中固定，进行苏木精-伊红(HE)染色，采用医学图像分析软件测定支气管壁的厚度，用以衡量气道重塑的程度[8]。

2 结果

2.1 各组大鼠雾化吸入后行为改变情况 A组大鼠行为无任何异常表现，B组大鼠在激发10 min后出现呼吸加快加深、躁动不安，后期可见点头呼吸、前肢缩抬，严重者可出现哮鸣音、皮肤紫绀等。C组、D组、E组大鼠均出现类似B组大鼠症状，但较B组减轻,大鼠行为改变程度为C组gt;D组gt;E组。

2.2 气道形态学测定结果比较

2.2.1 WAt(管壁总面积)/Pbm(支气管基底膜周径)、平滑肌面积(WAm)/Pbm B、C、D、E组与A组相比气道壁出现明显增厚(Plt;0.01)；C、D、E组的气道壁厚度明显低于B组(Plt;0.05)；D、E组的气道壁厚度明显低于C组(Plt;0.05)，与A组相比气道壁厚度无明显差异(Pgt;0.05)。见表1。

2.2.2 内壁面积(WAi)/Pbm B与A组相比气道壁出现明显增厚(Plt;0.05)；C、D、E组与A组相比气道壁厚度无明显差异(Pgt;0.05)。见表1。

注：与正常组相比，#Plt;0.01；与模型空白组相比，△Plt;0.01；与地塞米松组相比，◇Plt;0.05。

2.3 各组大鼠血液指标比较情况 B、C、D、E组的TNF-α、IL-17水平较A组明显增高(Plt;0.01)，提示哮喘模型大鼠制备成功；C、D、E组的TNF-α、IL-17水平明显低于B组(Plt;0.05或Plt;0.01)；D、E组的TNF-α、IL-17水平明显低于C组，差异具有统计学意义(Plt;0.05)；D、E2组的TNF-α、IL-17水平之间无明显差异(Plt;0.05)。见表2。

表2 各组大鼠治疗后血液学指标变化情况 ng/mL

注：与正常组相比，#Plt;0.01；与模型空白组相比，△Plt;0.01；与地塞米松组相比，▲Plt;0.05。

3 讨论

支气管哮喘是以呼吸道高反应性和慢性炎症为主要特征的慢性呼吸道疾病，调查表明：支气管哮喘的发病率约为18%，呈逐年上升的趋势，每年大约有18万人死于该病[9-10]。实验研究[11]证明，哮喘最重要的免疫学异常是Th1/ Th2的失衡，主要体现在Th2细胞数目的增多及功能的亢进[11]。在支气管哮喘动物模型或者是临床哮喘患者中，都会出现Th1/Th2的失衡状态,此时两者释放的细胞因子都会导致哮喘特征性病理生理的变化。但是随着研究的进一步深入,研究人员发现，Th1/Th2失衡理论并不能完全解释哮喘的进程，而Th17细胞亚群的发现恰恰弥补了这个缺陷，其分泌的IL-17与哮喘的发生有着密切关系。

IL-17是一种前炎症因子，在机体中同时参与固有免疫和获得性免疫反应过程[12]。国外研究报道提示IL-17可以通过刺激间叶细胞来分泌二级前炎症因子，使得中性粒细胞在炎症区域内聚集。[13]国外研究显示IL-17可以明显促进嗜酸性粒细胞的趋化，并使其释放大量的细胞因子和化学介质,增强机体的炎症反应。[14]TNF-α是由单核巨噬细胞产生的一种多肽调节因子，其可以引起支气管的高反应性[15]，同时它还可像IL-17一样聚集支气管内的炎症细胞,产生多种炎症递质。研究显示，TNF-α可以上调血管内皮细胞、嗜酸性粒细胞膜上表达的黏附分子，而这些黏附分子与气道高反应性的形成密切相关。

本实验采用OVA联合雾化吸入的方法复制哮喘大鼠模型,观察射干麻黄汤与地塞米松对哮喘大鼠作用的差别。结果显示，中药组的黏膜、平滑基层以及气道壁都出现显著的增厚，说明射干麻黄汤可以抑制哮喘气道重塑，改善患者临床症状，且其剂量越高，抑制气道重塑的效果越明显。治疗组哮喘大鼠TNF-α、IL-17的含量明显低于模型空白组,治疗后中药组大鼠的炎症因子已经开始逐渐接近正常组,其降低TNF-α、IL-17的速度明显快于地塞米松组。但是本实验只是单纯的从TNF-α、IL-17去探讨了射干麻黄汤对哮喘大鼠的作用机理,对于射干麻黄汤的最佳作用剂量、加减作用、对于气道重塑的影响的有效部位等更加复杂的问题，需要深入细致的研究。

[1]刘志刚.现代临床免疫学[M].辽宁:辽宁科技出版社,1995:102.

[2]陈强.支气管哮喘与呼吸道重塑[J].实用儿科临床杂志,2004,19(10):819-821.

[3]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2008,31(3):177-185.

[4]Barnes PJ.Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].Nat RevImmuno1,2008,8(3):183-192.

[5]欧阳若芸,胡成平,陈平,等.哮喘中Th1/Th2类细胞因子免疫失衡对神经生长因子表达的影响[J].中南大学学报(医学版),2007,32(1):119-123.

[6]Palmans E,Kips JC,Pauwels RA.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2):627-635.

[7]Salmon M,Walsh DA,Koto H,et al.Repeated allergen exposure of sensitized Brown-Norway rats induces airway cell DNA synthesis and remodeling[J].Eur Respir J,1999,14(3):633-641.

[8]刘莉,余可斐,穆敬平,等.地塞米松对哮喘大鼠气道重建、肥大细胞及IL-10的影响[J].中华肺部疾病杂志(电子版),2012,5(1):17-23.

[9]Yeh KW,Chiang LC,Huang JL.Epidemiology and current status of asthma and associated allergic diseases in Taiwan- ARIA Asia-Pacific Workshop report[J].Asian Pac J Allergy Immunol,2008,26(4):257-264.

[10]Schnyder-Candrian S,Togbe D,Couillin I,et al.Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma[J].J Exp Med,2006,203:2715-2725.

[11]Romagnani S.The role of lymphocytes in allergic disease.Jallergy Clin Immunol,2000,105:399-408.

[12]Ouyang,W.The biological functions of T helper l7 cell effector cytokines in inflammation[J].Immunity,2008,28:454-467.

[13]Hoshino,H.Increased elastase and myeloperoxidase activeity associated with neutrophil recruitment by IL-17 in airways in vivo[J].Allergy Clin Immunol,2000,105:143-149.

[14]Cheung PF,Wong CK,Lam CW.Molecular mechanisms of cytokine and chemokine release from eosinophils activated by IL-17A.IL-17F and IL-23:implication for Th17 lymphocytesmediated allergic inflammation[J].J Immunol,2008,180:5625-5635.

[15]Brightling C,Berry M,Am rani Y.Targeting TNF-α alpha:a novel therapeutic capp roach for asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2008,121(1):5210.

EffectofSheganMahuangDecoctiononAirwayRemodelingandExpressionofTNF-αandIL-17inAsthmaticRats

CAO Hui

(Department of Chest Surgery,Nanjing Thoracic Hospital,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo investigate the influence ofSheganMahuangDecoctionon airway remodeling and expression of TNF-αand IL-17 in asthmatic rats.MethodsRats were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA) to establish the asthmatic model.Fifty SD rats were randomly divided into five groups.The expression of TNF-α and IL-17 in lung tissues were detected by immunohistochemistry.The paraffin embedded sections of lung tissue were observed.ResultsExpression levels of TNF-α and IL-17 in the epithelial cells of bronchi ofSheganMahuangDecoctiongroup were decreased obviously than in dexamethasone group(Plt;0.05) and in the control group(Plt;0.01).ConclusionRepeated exposure of allergen induces airway inflammation and remodeling.SheganMahuangDecoctionrestrain the increase of thickness of total airway wall and smooth muscle by inhibiting TNF-α and IL-17 degranulation in lung tissue.

bronchial asthma;airway remodeling;TNF-α;IL-17;SheganMahuangDecoction;rats

R285.5

A

1003-5699(2013)12-1258-03

曹 珲(1978-),男，大学本科，主治医师。研究方向：心胸外科。

2013-04-25)