丛懿洁，孙为正，崔 春，赵谋明，杨园媛

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641）

在肉制品加工过程中，腌制是常见工序之一。腌制是通过在肉腌制过程中添加腌制剂以利于加强肉的保存性、形成成熟风味，提高肉的发色性和保水性，施加咸味。腌制剂通常使用食盐、亚硝酸钠等发色剂、复合磷酸盐等保水剂、香辛料和食糖等。肉在腌制中所产生的变化主要有：由蛋白质分解产生组织的柔软化，生成肽、氨基酸等呈味成分，由脂肪分解生成脂肪酸、醛等风味成分，由糖类分解生成有机酸、乙醇等[1]。通过腌制，组织、风味等特征都由生肉转化为加工品。肉的腌制已作为重要的加工手段在生产中广泛应用，其在肉制品加工中占有十分重要的地位。肉类在冻藏过程中硬度变大，色泽变深，水分蒸发产生干耗，导致最终肉品质的劣变，且冻藏过程中蛋白质变性，肉中的内源性酶在低温下活性降到最低甚至几乎没有活性，而内源性酶如组织蛋白酶在肉中的作用极为重要，它们在肉类的成熟过程中扮演重要角色，可引起肉的嫩化及肉中蛋白质降解和风味物质形成[2]。木瓜蛋白酶因其稳定性好，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等均具有强的水解能力，是最常用的植物蛋白酶[3]。国内关于木瓜蛋白酶对肉的研究一般局限在通过测定肉的剪切力来判定肉嫩度的变化，关于腌制过程中添加蛋白酶对肉其他品质的影响尚鲜有报道。肉腌制中添加木瓜蛋白酶，不仅改善肉的质构特性，同时由酶降解肉蛋白形成氨基酸等多种小分子风味物质，更易溶于水中，提高肉的保水性，从而提高生肉糜在冷藏期间的品质；在后期肉熟化过程中，这些氨基酸更易于与肉中添加的糖结合进行美拉德反应，得到新的风味化合物，从而增加肉制品的口感和风味，并且美拉德反应产物具备一定的抗氧化能力，能够延长肉制品的货架期[4]。因此，肉制品加工前期加酶腌制对肉糜品质的研究十分有必要，实验通过在肉糜中添加不同含量的木瓜蛋白酶，测定肉糜水溶性提取物中的总氮和氨氮的含量来确定酶对肉中蛋白的降解作用程度，并对肉糜进行质构、色泽等分析，在一定程度上对冻藏肉中内源酶活性降低形成补缺作用，同时为肉糜的腌制及肉制品的后期加工提供一定的理论依据，对实际肉制品的加工和生产具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料肉 购于华南理工大学后勤综合楼；木瓜蛋白酶（8.0×105U/g） 广州裕立宝生物科技有限公司；六偏磷酸盐、多聚磷酸盐、焦磷酸盐等 均为分析纯；食盐、食糖等 均购于华南理工大学后勤综合楼。

MM12型绞肉机 广东省韶关市食品机械厂；CT-400型色差仪 柯尼卡美能达光电股份有限公司；TA.XT2i型物性测试仪：配有P/50探头 美国Micro Stable公司；KDN-102F型自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；TIM 840型甲醛滴定仪 法国Radiometer analytical公司；Dew Point 4TE型水分活度仪 美国Aqualab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肉糜配方（以投料计） 瘦肉∶肥肉=8∶1；食盐：2%；食糖：15%；复合磷酸盐（六偏磷酸盐∶多聚磷酸盐∶焦磷酸盐=1∶1∶1）：0.3%；木瓜蛋白酶：0%～0.10%。

1.2.2 测定方法 将原料肉绞碎，所用孔板直径为6mm，根据以上配方添加腌制剂，滚揉后置于4℃冰箱腌制18h。将腌制好的肉糜分为两部分，一部分以1∶10比例加蒸馏水，并在8000r/min高速均质1min，10000r/min离心20min，取上清液备用。剩下的肉糜留备用。

清液总氮测定：采用KDN-102F自动定氮仪测定。

清液氨氮测定：采用TIM 840甲醛滴定仪测定。

肉糜色差测定：采用CR-400便携式色差仪测定CIE L*，CIE a*，CIE b*。

肉糜水分活度测定：采用Dew Point 4TE水分活度仪测定。

肉糜pH的测定：称取5g腌制好的猪肉糜到小烧杯中，加入45mL蒸馏水，作10倍稀释，搅拌30min。室温静置10min左右，将电位计上的玻璃电极直接插入烧杯中的肉和水混合物内，3～5s内数据稳定后读数[5]。

肉糜物性指标的测定：采用物性测试仪测定腌制后肉糜的质构特性，参数设定按照文献[6]稍作调整。具体测定参数如下：探头P/50；测前速度2mm/s，测中速度1mm/s，测后速度2mm/s，间隔时间5s，数据收集率200点/s，压缩比50%，触发力5g，触发类型auto，每组6个重复。测试完用自带的软件Texture Expert Exceed 2.64a内部宏TPA.MAC对测试结果进行处理。

1.2.3 统计分析 实验数据以平均数±标准差表示，应用SPSS 18.0软件包对各指标进行分析，差异性分析采用邓肯（Duncan）法，相关性分析采用皮尔逊（Pearson）法。应用Origin 7.5进行作图。

表1 TPA实验主要参数及其定义Table 1 Main parameters and definition of TPA

2 结果与讨论

2.1 肉糜水溶性总氮和氨氮的变化

表2 不同添加量的酶对水溶性总氮及氨氮含量的影响Table 2 Effect of different enzyme content on water soluble total nitrogen and ammonia nitrogen

由表2可见，腌制过程中随着木瓜蛋白酶添加量的增加，肉糜的水溶性总氮、氨氮含量均显著升高（p＜0.05），其中总氮含量提高了1.2倍，氨氮含量提高了5倍。由此可知，肉糜在加入少量的酶腌制后发生一定的降解作用，大分子蛋白降解成小分子肽、氨基酸等，这些小分子更易溶于水而被提取出来。且随着酶添加量的增加，酶的作用效果越明显，降解作用程度越大，生成的游离氨氮越多。P Gou[7]发现，随着腌制时间增加，总氮和非蛋白氮含量均显著升高（p＜0.05）。实验结果表明，在4℃条件下，木瓜蛋白酶仍具备一定活力，对肉中蛋白降解作用也十分明显。

2.2 肉糜水分活度的变化

表3 不同添加量的酶对肉糜水分活度的影响Table 3 Effect of different enzyme content on water activity

由表3可以看出，当酶添加量不大于0.08%时，随着酶添加量的增加，肉糜水分活度没有显著性变化（p＞0.05），但当酶添加量达到0.10%时，肉糜的水分活度显著降低（p＜0.05）。分析实验原因，由于酶添加量较低，其嫩化程度较低，未起到提高肉糜保水性的作用，当酶添加量达到0.10%时，肉在木瓜蛋白酶的作用下降解程度较大，木瓜蛋白酶将肌动球蛋白分解为肌动蛋白和肌球蛋白，肌动蛋白易溶于水，使肉糜的保水性增强，从而使肉糜的水分活度显著降低。

2.3 肉糜pH的变化

图1 不同添加量的酶对pH的影响Fig.1 Effect of different enzyme content on pH

由图1可见，与对照组相比，添加酶后，pH显著降低（p＜0.05），且随着酶添加量的增加，pH保持降低趋势，即酶添加量对肉糜pH具有显著影响（p＜0.05）。理论上，由于木瓜蛋白酶作用于肉中肌原纤维蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等，蛋白质降解时会有羧基和氨基产生，而羧基会电离产生H+，使pH下降，由此设想，随着降解反应的进行，pH不断下降。谭光轩[8]在探究木瓜蛋白酶水解蛋白质pH变化与可溶性蛋白关系的实验中发现，在酶解大豆蛋白时，随着酶添加量升高（1%～7.5%），豆浆浓度下降（7%～1%），起始pH降低（9%～6.3%），且pH下降速度加快，可溶性蛋白含量增加，水解产物增加。崔春等[9]研究不同酶解时间对pH的影响，其实验发现一般肽键的打开会导致pH下降，在相同初始pH条件下，随着酶解时间的延长，反应前后体系pH降低的幅度逐渐增加。

2.4 肉糜色差的变化

图2 不同添加量的酶对肉糜色差的影响Fig.2 Effect of different enzyme content on color

由图2可见，与对照组相比，腌制中添加酶后，对肉糜各色差值均有显著影响（p＜0.05）。其中CIE L*在酶添加量为0.08%时达到最大值，相对对照组提高了10.56%；CIE a*，CIE b*均在酶添加量为0.04%时达到最大值，其中红度值提高了23.58%，黄度值提高了65.34%。当酶添加量继续增加时，各色差值呈波动性变化，但变化不显著。Rubén Garrido[10]发现，经过腌制后，红度值和黄度值都增加。

分析原因可能是，酶作用后，体系pH下降，使得肉糜表面变白，从而导致肉糜亮度值增加。根据Jay等[11]的报道，pH的下降可引起肉表面产生褪色漂白的效果，这是由于保护亚铁血红素的球蛋白在低pH下变性导致的。肉糜中添加的糖结合生成一些复杂的分子，导致肉糜红度值增加。肉中食盐及脂肪的作用可能导致黄度值增加，Soyer[12]研究表明，如脂肪含量、斩拌、滚揉、冻藏等工艺条件对CIE b*有较大影响。在酶添加量为一定范围内，当酶添加量继续增加时，由于酶的作用达到一个相对极限的程度，使得色差值变得相对稳定，没有显著性变化。

2.5 肉糜TPA质构的变化

图3 不同添加量的酶对肉糜硬度、胶性、咀嚼性的影响Fig.3 Effect of different enzyme content on hardness，gumminess and chewiness

由图3可见，腌制过程中添加木瓜蛋白酶使得肉糜的硬度、胶性显著下降（p＜0.01），分别下降了59.06%、37.63%，但当酶添加量大于0.02%时，肉糜硬度没有显著性变化（p＞0.05）；当酶添加量小于等于0.04%时，肉糜的咀嚼性没有显著性变化，当酶添加量大于0.04%时，肉糜咀嚼性相对对照组显著下降（p＜0.05）。

分析原因是由于木瓜蛋白酶对肉产生作用，其作用组织主要是肌动球蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，木瓜蛋白酶能将肌动球蛋白分解为肌球蛋白和肌动蛋白[13-15]。胶原蛋白和弹性蛋白是结缔组织的主要成分，木瓜蛋白酶对这两种蛋白质的作用能使结缔组织降解成无定形的小块，导致肉的嫩化[16]。Chunghee K Kang和Eldone Rice研究了菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、胰酶应用于肉中的嫩化效果，结果发现木瓜蛋白酶对水溶性、盐溶性和不溶性肌肉组织片段都有较好的水解效果[17]。肌原纤维断裂，肌纤维结构完整性的破坏，导致肉的硬度下降，使肉变得更加细腻和柔和。明建等[18]利用TAXT2i物性测定仪，研究了蛋白酶嫩化处理对牛肉及其制品物性的影响，结果表明，蛋白酶处理显著降低了牛肉的烹饪失水率、剪切力、咀嚼性、弹性、回复性、黏聚性等物性指标，处理后牛肉的口感较好，没有口感粗糙、韧性大而咀嚼费力的特征。杨艳等[19]利用木瓜蛋白酶对牛肉干进行嫩化，得出结果，随着木瓜蛋白酶添加量的增加，牛肉干的硬度、咀嚼度均有所降低，降低了牛肉干的韧性，使之更易咀嚼，而且提高牛肉干的口感。

图4 不同添加量的酶对肉糜弹性、凝聚性的影响Fig.4 Effect of different enzyme content on springiness and cohesiveness

由图4可以看出，木瓜蛋白酶对肉糜的弹性没有显著性变化（p＞0.05）；与对照组相比，添加酶的各组肉糜凝聚性显著提高（p＜0.05），但各组没有显著性差异，即酶添加量对凝聚性没有显著影响。肉糜凝聚性提高可能是由于酶对肉蛋白进行降解，蛋白分子量下降，且产生小分子肽、氨基酸，这些物质更易于促进凝聚、交联，提高持水性和乳化活性。熊善柏等[20]报道，蛋白质经蛋白酶适度水解，保持和改进营养价值，降解生成小分子能够改善其溶解性、乳化性、起泡性、持水性等功能特性。

由图5可以看出，添加木瓜蛋白酶后，肉糜的黏着性显著提高（p＜0.01），但在不同酶添加量的肉糜的黏着性中，添加量为0.08%较0.02%显著提高（p＜0.05），其他各添加量的肉糜的黏着性没有显著性差异（p＞0.05）。这可能是由于木瓜蛋白酶作用于肌动球蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等的程度不同，导致所形成的小分子的不同，从而使黏着性在表观上呈现不同。肉蛋白经酶作用后，肌原纤维断裂，在食盐和食糖的作用下，肉糜变得柔软，黏着性提高。杨艳等[19]利用不同含量的木瓜蛋白酶对牛肉干进行嫩化，得到了同样的结果，其分析结果为木瓜蛋白酶可以使牛肉干中的结缔组织以及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，在一定程度上破坏了它们的结构。

图5 不同添加量的酶对肉糜黏着性的影响Fig.5 Effect of different enzyme content on adhesiveness

2.6 相关性分析

由表4可知，CIE L*、CIE a*、CIE b*各色差值之间呈现显著相关性（p＜0.05），其中CIE a*、CIE b*之间呈现极显著相关性（p＜0.01）；各色差值和硬度、黏着性、凝聚性、胶性、咀嚼性之间均呈现显著相关性（p＜0.05），其中CIE L*和胶性、咀嚼性呈现极显著负相关性（p＜0.01），CIE b*和胶性、咀嚼性、硬度均呈现极显著负相关性（p＜0.01）；表明肉糜的色泽和肉糜TPA质构各项指标之间具有良好的相关性。这种外在的相关性只是说明蛋白酶对猪肉糜作用使肉的色泽和肉的质构特性均发生变化，且二者呈现相反的变化趋势，但对于肉的色泽与质构二者之间本身并不具备实际意义上的关联性。

表4 各指标之间的相关性分析Table 4 The relationship analysis between the index

关于TPA质构的各项指标中，咀嚼性和凝聚性之间呈现显著负相关性（p＜0.05），除弹性其他各项指标之间存在极显著相关性（p＜0.01）；表明肉糜的质构各项指标具有很好的相关性，这从各项指标的定义也能看出来。Di Monaco等对15种食品的感官质地研究也表明硬度与易嚼性呈显著正相关[21]。

除水分活度外，氨氮和CIE a*之间呈现显著相关性（p＜0.05），和其他各指标之间均呈现极显著相关性（p＜0.01）；表明酶对蛋白的降解作用以及对肌纤维的断裂作用等都是同时进行，它们之间具备良好的相关性。除弹性、水分活度外，pH与其他指标也均呈现良好的相关性（p＜0.05），pH影响的是肉糜的内环境，当内环境发生微小变化，会以各项表观指标表现出来，包括质构、色差等。

3 结论

3.1 腌制过程中添加木瓜蛋白酶，肉糜中的水溶性总氮和氨氮含量显著提高（p＜0.05），其中总氮含量提高1.2倍，氨氮含量提高5倍。

3.2 由于酶解作用，使得肉蛋白中肽键断裂，生成氨基酸等物质，从而使pH呈显著下降趋势（p＜0.05）。

3.3 肉糜加酶腌制后硬度、胶性呈极显著下降趋势（p＜0.01）；当酶添加量较小时，肉糜的咀嚼性没有显著性变化，当酶添加量大于0.04%时，肉糜咀嚼性相对对照组显著下降（p＜0.05）；凝聚性、黏着性呈显著升高趋势（p＜0.05）；弹性没有显著性变化（p＞0.05）。

3.4 腌制中添加酶后，对肉糜各色差值均有显著影响（p＜0.05）。其中CIE L*相对对照组提高了10.56%，CIE a*提高了23.58%，CIE b*提高了65.34%。

3.5 由相关性分析可知，色差值、TPA质构、氨氮、pH它们各自之间均具有良好的相关性，结果表明添加木瓜蛋白酶腌制对肉糜进行嫩化以及肉蛋白的降解和其内发生的各种理化变化具有一定的相关性。

[1]杨淑芳，李玉伟.腌制的目的及其色泽变化机理[J].肉类工业，2001（7）：8-10.

[2]黄鸿兵.冷冻及冻藏对猪肉冰晶形态及理化品质的影响[D].南京：南京农业大学，2002.

[3]李培红，王怀欣，郇延军.复合磷酸盐和木瓜蛋白酶对猪肉脯嫩化效果对比研究[J].肉类工业，2011（2）：25-26.

[4]王延平，赵谋明，彭志英，等.美拉德反应产物抗氧化性能研究进展[J].食品与发酵工业，1997，24（1）：71-73.

[5]丛懿洁，孙为正，杨园媛，等.茶多酚和TBHQ对猪肉脯贮藏过程中色泽的影响[J].食品工业科技，2012（21）：323.

[6]Bourne MC.Texture profile analysis[J].Food Techonology，1978，32（7）：62-66.

[7]Gou P，Morales R，Serra X，et al.Effect of a 10-day ageing at 30℃on the texture of dry-cured hams processed at temperatures up to 18℃in relation to raw meat pH and salting time[J].Meat Science，2008，80：1333-1339.

[8]谭光轩.木瓜蛋白酶水解蛋白质的pH变化与溶性蛋白的关系[J].周口师专学报，1994，11（2）：30-32.

[9]崔春，赵谋明，刘珊，等.低值鱼蛋白酶解产物对酱香型美拉德反应产物风味的影响[J].现代食品科技，2006，22（2）：9-11.

[10]Rubén Garrido，Rubén Domínguez，José M，et al.Effect of the length of salting time on the proteolytic changes in drycured lacón during ripening and on the sensory characteristics of the final product[J].Food Control，2012，25：789-794.

[11]Jay B，Fox JR.The pigments of meat[M].The Science of Meat and Meat Products，1987：193-216.

[12]Soyer A，Ertas AH，Uzumcuoglu U.Effect of processing conditions on the quality of naturally fermented Turkish sausages（sucuks）[J].Meat Science，2005，69：135-141.

[13]Mohammad Kohmaraic.Biochemical factors regulating the toughening and tenderization processes of meat[J].Meat Science，1996，43：193-201.

[14]Hill F.The solubility of intramuscular collagen in meat animals of various ages[J].Food Science，1966，31：161.

[15]Chunghee K，Kang，Eldone，et al.Degradation of various meat fractions by tendering enzymes[J].Food Science，1970，35：563.

[16]刘登勇.食品添加剂在肉类嫩化中的应用[J].肉类工业，2003（3）：26-30.

[17]谢超，刘鹭.几种肉类蛋白酶嫩化剂的比较[J].肉类工业，2003（2）：29-31.

[18]明建，李洪军.不同酶嫩化处理对牛肉物性的影响[J].食品科学，2008，29（12）：156-158.

[19]杨艳，于功明，王成忠.木瓜蛋白酶对牛肉干品质的影响[J].肉类工业，2009（7）：45-47.

[20]熊善柏，赵山，王启明，等.木瓜蛋白酶在乌鸡肉蛋白质分步酶解中的应用研究[J].食品科学，2000，21（12）：26-29.

[21]Di Monaco R，Cavella S，Masi P.Predicting sensory cohesiveness，hardnessand springinessofsolid foodsfrom instrumental measurments[J].Journal of Texture Studies，2008，39（2）：129-149.