梁引库

（陕西理工学院，陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723000）

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz）为菊科多年生草本植物[1-2]，是一种药食两用的多年生草本植物，在我国具有悠久使用历史。但是在以往的利用中，主要是以药用为主。临床上蒲公英常用于胃炎、乳腺炎、胆道感染[3]、十二指肠炎[4]、阑尾炎[5]、病毒性肝炎[6]、胰腺炎[7]等多种炎症的治疗。在抗氧化方面，300μg·mL-1的蒲公英水提物对缺氧缺糖心肌细胞[8]、四氯化碳诱导原代大鼠肝细胞损伤[9]都有一定的保护作用。蒲公英也可增加机体内源性抗衰老物质活性，抑制脂质过氧化反应，或具有直接清除自由基作用，对延缓衰老具有十分重要的意义[10]。以上研究都提示蒲公英具有很好的抑菌和抗氧化的能力。但是这些对蒲公英的研究主要集中在药用成分上，而开发关于蒲公英的食品添加剂方面的研究很少见报道，尤其是关于开发蒲公英天然防腐剂方面的研究在国内外还未见报道。本研究通过提取蒲公英根脂溶性成分，利用气相色谱质谱联用仪分析鉴定蒲公英根的脂溶性成分组成，并对蒲公英的脂溶性成分的抗氧化活性和抑菌活性进行了初步的分析研究，探究其抗氧化能力和抑菌效果，从而为开发具有抗氧化功能和抑菌功能的天然、无毒的食品添加剂或者天然食品抗氧化剂、天然食品防腐剂提供理论研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巨大型蒲公英 由青海省农科院提供，花期采收，经陕西理工学院李新生教授鉴定为蒲公英，药材干燥粉碎过80目筛；乙醚、石油醚、苯、甲醇、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、番红花红、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、浓硫酸、硫酸钠、钼酸铵、三羟基甲烷、盐酸（37.5%）、邻苯三酚、米勒-海顿琼脂、二甲基亚砜试剂 均为分析纯；大肠埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25925）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis，CMCC63501）、白假丝酵母菌（Candida albicans，CMCC85021） 以上菌株冻干菌种由中国药品生物制品检定所中国医学细菌保藏中心提供，-80℃低温冰箱冻存，实验前复苏传代使用。

GC-MS ITQ900型气相色谱质谱仪 美国热电；FA2204B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；HH-S4型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱 南京晓晓仪器设备有限公司；JJ-2（2003-61）型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市环宇科学仪器厂；UV2550型分光光度计日本岛津公司；YXQ-LS-50 SⅡ型全自动立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BIO1500-Ⅱ-A2型生物安全柜 上海振梓创空气净化设备有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Ф3mm琼脂平板打孔器 西安交通大学医学院仪器维修厂加工生产；Ф6mm滤纸片121℃30min高压蒸汽灭菌，80℃烘干备用 本室制备；一次性9cm无菌培养皿 江苏康健医疗用品有限公司，批号：20100315。

1.2 实验方法

1.2.1 蒲公英脂溶性成分的提取 花期采收蒲公英根，洗净后于120℃杀青，80℃下烘至衡重，粉碎过80目筛；取一定量蒲公英根粉末于索氏提取仪中，以乙醚为提取溶剂，提取蒲公英根中的脂溶性成分；提取物与水1∶1混合，离心静置分层，取乙醚层，弃水层和沉淀，重复3次；干燥乙醚层可得蒲公英脂溶性成分初步纯化产品。

1.2.2 蒲公英脂溶性成分的甲酯化 取蒲公英根的脂溶性成分1g于100mL容量瓶中，加入16mL苯和石油醚的混合液（苯和石油醚体积比为1∶1），充分振荡使其溶解。再加入0.8mol·L-1的KOH-甲醇溶液，振荡5min，最后加入蒸馏水至刻度线。静止30min，用微量注射器吸取一定量的上层液，再用体积比1∶1的苯和石油醚混合液稀释[11，19]，GC-MS检测。

1.2.3 GC-MS分析条件 色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱（30m×250μm×0.25μm）；载气为氦气（99.999%），流量1mL·min-1；柱前压63kPa，进样口温度250℃；程序升温：初始温度80℃，然后每分钟8℃升温至150℃，再以每分钟5℃升温至210℃，保留3min，然后从210℃以4℃·min-1升温至230℃，然后以每分钟5℃升温至280℃并保留15min；进样量：0.2μL；分流比40∶1。MS条件：EI离子源：70eV；离子源温度230℃；连接器温度250℃；溶剂延迟3min；加速电压250eV；扫描质量范围为50～550amu。

1.2.4 对羟基自由基的清除 Fenton氧化法。取0.15mol·L-1、pH7.4的磷酸缓冲溶液1.0mL，40μg·mL-1番红花1.0mL，0.945mmol·L-1EDTA-Fe（Ⅱ）（新鲜配制）1.0mL，不同浓度的样品溶液0.5mL，3%的H2O21.0mL（新鲜配制），混合后在37℃水浴中反应30min后在520nm处测定吸光度。空白组以0.5mL蒸馏水代替样品测定吸光度A0，对照组以1.5mL蒸馏水代替H2O2和样品测定吸光度A，用3.5mL蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe（Ⅱ）、H2O2、样品，1.0mL磷酸盐缓冲溶液，调零。并按下式计算清除率[14-15]。

1.2.5 总抗氧化活性的测定——磷钼络合物法 配制不同浓度的样品溶液。磷钼试剂是终浓度为0.6mol·L-1浓硫酸、28mmol·L-1磷酸钠和4mmol·L-1钼酸铵的溶液。在10mL比色管中，分别加入4mL上述磷钼试剂液、0.4mL样品液，95℃水浴中恒温90min，在695nm波长下测吸光度A。所有测定平行进行三次，取平均值[16]。

1.2.6 对超氧阴离子的清除作用——邻苯三酚自氧化 取配好的Tris-HCL缓冲液4.5mL、4mL蒸馏水在25mL的试管中混匀后在37℃水浴中保温25min，取出后立即加入在37℃预热过的邻苯三酚0.5mL，迅速摇匀后倒入比色皿，325nm下每隔30s测定吸光度。计算线性范围内每分钟吸光度的增加，以10mmol·L-1HCL溶液配制空白光作为对照，记录结果[17]。

按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入1mL不同浓度的样品溶液，同样以10mmol·L-1HCL溶液配制空白管作为对照，测定吸光度。按下列公式计算抑制率：

式中：△A1/△t为邻苯三酚自氧化时反应速率；△A2/△t为加入样品后邻苯三酚自氧化速率。

1.2.7 脂溶性成分的抑菌实验

1.2.7.1 菌体复苏 将实验菌种复苏，传代于肉汤培养基，37℃培养18～24h。与麦氏比浊管比浊法测定细菌数，用10%二甲基亚砜无菌去离子水配制成106CFU·mL-1菌液备用。

1.2.7.2 样品处理 将样本瓶精确称重。取1mL二甲基亚砜加入到样本瓶，用力振摇使油剂样本溶解。将溶解的样本完全吸出至无菌试管。再将样本瓶精确称重，减重法计算样本量和样本溶液浓度，用无菌20%二甲基亚砜去离子水调配样本浓度至测试浓度。在96孔细胞培养板上用20%二甲基亚砜将样本液做连续二倍梯度稀释5个梯度，每个梯度0.2mL。

1.2.7.3 微孔扩散法 于培养皿中加实验菌液0.2mL，倾注加热融化后冷却至50℃的10%二甲基亚砜MHA 20mL，快速混合，室温静置待培养基冷凝。用打孔器在平板上打孔，孔径3mm。按标记加入各梯度浓度样本液20μL/孔。溶剂对照孔加DMSO 20μL，阳性对照孔加0.5%碘伏溶液20μL。

1.2.7.4 纸片抑菌法 制备MHA平板，滴加实验菌液50μL至平板表面，用无菌L形玻棒将菌液涂匀。用微量移液器吸取不同浓度梯度的样本液10μL分别滴加到直径6mm无菌滤纸片上，将滤纸片贴于平板表面。溶剂对照纸片含10μL的DMSO，阳性对照纸片含10μL的0.5%碘伏溶液。

1.2.7.5 培养 将平板倒置，于4℃冰箱静置6h，移入普通培养箱，37℃培养24h后观察实验结果，测定样本孔（纸片周围无细菌生长的抑菌环直径：抑菌环直径微孔扩散法大于5mm，纸片法大于8mm判为抑菌阳性，低于此标准的判为抑菌阴性）。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS检测蒲公英根脂溶性成分

图1 蒲公英根脂溶性成分GC-MS图Fig.1 GC-MS chromatograms of Dandelion roots liposoluble constituents

表1 GC-MS分析蒲公英根的脂溶性成分Table 1 Gas mass spectrometry results in the determination of liposoluble constituents of the dandelion roots

GC-MS分析蒲公英根中脂溶性成分发现（见图1、表1），蒲公英根中含有27种化合物，对这27种化合物进行分析表明，蒲公英根中主要有十六酸、9，12-十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸等。十六酸、9，12-十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸的相对百分含量分别为：20.3%、24.8%和20.1%，三种物质的总量占脂溶性成分的65.2%。

2.2 蒲公英根的抗氧化活性

图2 蒲公英根脂溶性成分对羟基的清除Fig.2 Dandelion roots of liposoluble constituents of the hydroxyl radicals

2.2.1 对羟基自由基的清除 图2表明，随着样品浓度的增大，蒲公英根脂溶性成分对羟基自由基的清除率越高，当浓度为1.6mg·mL-1时蒲公英根脂溶性成分对羟基自由基的清除率最大，为59.1%。但是当蒲公英根脂溶性成分的浓度大于0.8mg·mL-1时，其对羟基自由基的清除能力趋于平稳。莫云燕等研究发现[18]，VC清除50%的羟基自由基所需浓度为0.1031mg·mL-1，而蒲公英脂溶性成分清除50%羟基自由基所需浓度约为0.8mg·mL-1，由此可见蒲公英根脂溶性成分对羟基自由基的清除能力低于VC的清除能力。

2.2.2 总抗氧化活性的测定 在所测定的浓度范围内，蒲公英根脂溶性成分的吸光度随浓度增加而逐渐加强，表明总抗氧化活性逐渐增强（见图3）。当蒲公英根脂溶性成分浓度为3mg·mL-1时，根脂溶性成分的吸光度最大，为0.975，表明其总抗氧化能力也最强。从总体的变化趋势看，其总抗氧化活性随着浓度的增高而增高，但与浓度不成线性关系。

图3 磷钼络合物法测样品的总抗氧化活性Fig.3 Phosphomolybdate complex method measured sample of the total antioxidant activity

2.2.3 超氧阴离子自由基清除作用 采用邻苯三酚自氧化法测试了蒲公英脂溶性成分对邻苯三酚自氧化过程中产生的超氧阴离子的抑制作用。实验结果表明（见图4），随着样品浓度的增加，对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的抑制作用越强，当浓度为1.6mg·mL-1时，根的抑制率最高，抑制率为29.9%。而李瑞光[19]研究发现，VC对超氧阴离子的抑制率达到50%时，其浓度约为0.2mg·mL-1；袁建锋[20]研究发现，VC对超氧阴离子的抑制率达到50%时，其浓度约为0.101mg·mL-1，其浓度低于蒲公英根抑制率为29.9%的抑制浓度。由此可见蒲公英根脂溶性成分对超氧阴离子的抑制能力低于VC，但是还具有较好的抑制能力。

2.3 脂溶性成分的抑菌实验

在4株实验菌平板上，对照DMSO纸片和微孔周围无抑菌环，表明二甲基亚砜对细菌生长无影响。阳性对照0.5%碘伏溶液微孔和纸片周围均有大于1.5cm的抑菌环，表明实验方法无误。依据微量二倍连续梯度稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），同时采用平板转种法测定最小杀菌浓度（MBC）。蒲公英根脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌株、枯草芽孢杆菌株和白假丝酵母菌株4株实验菌株均有明显的抑菌作用。蒲公英根脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌的最小抑菌浓度分别为2.06、4.66、6.24和3.56mg·mL-1，最小杀菌浓度分别为3.12、5.82、8.68和4.98mg·mL-1。表明蒲公英根脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌具有良好的抑制能力，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制能力更强。

3 结论

微生物的大量繁殖和食品加工过程对食品的造成生物污染是食品腐败变质的主要因素，为了延长食品的保藏期，提高食品质量，人们在食品加工过程中添加各种活性物质使食品中的有害微生物失活并且降低食品被氧化变质的过程，而添加食品防腐剂和抗氧化剂就是其中一种主要的措施。但由于人们对食品添加剂的认识有限导致一些食品添加剂潜在危害未被发现，这给食品安全造成了一定的安全隐患。而天然防腐剂和抗氧化剂成分的毒性远远低于人工合成的，因此，近年来从自然界寻求天然食品防腐剂和抗氧化剂的研究已引起各国科学家的高度重视。

本研究对蒲公英根的脂溶性成分及其活性进行了分析研究，研究发现，蒲公英根脂溶性成分约有27种，主要有十六酸、9，12—十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸等。抗氧化实验研究表明，脂溶性成分具有较好的抗氧化能力，且抗氧化能力随着浓度的升高而增加，但其对羟基自由基、对超氧阴离子的清除能力低于VC。在抑菌方面，脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌株、枯草芽孢杆菌株和白假丝酵母菌株均有很好的抑制能力，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制能力最高，其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为：2.06mg·mL-1和3.12mg·mL-1。由此可见蒲公英脂溶性成分是一种良好抑菌物质，并且具有一定的抗氧化活性。

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