邵明飞，张宏宇，杨金萍，张允允，刘兆普，秦 松

(1.南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，南京210095;2.中国科学院烟台海岸带研究所生物资源实验室，烟台264003;3.烟台大学生命科学学院，烟台264003;4.中国科学院研究生院，北京100049)

藻蓝蛋白作为天然捕光色素蛋白，是由脱辅基蛋 白与藻蓝胆素(开链线性四吡咯)共价结合而成，其基本结构由α亚基(17000Da)和β亚基(19500Da)构成单聚体(αβ)，然后单聚体间通过连接肽构成三聚体(αβ)3或者六聚体(αβ)6，α 亚基84位处的半胱氨酸与β亚基84位处、155位处的半胱氨酸各通过硫醚键共价连接藻蓝胆素［1，2］。藻蓝蛋白无毒、无致癌性，具有抗氧化［3］、抗菌活性［4］、抗癌［5］、保肝护肝［6］、预防糖尿病［7］、清除自由基［8］等生理活性，其不仅作为天然色素、营养蛋白用于食品、化妆品行业，而且还可用作治疗氧化性疾病的药物及生物医药研究的荧光标记物［9］。藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种天然蓝色色素蛋白，占细胞干重的10%～20%。中国的螺旋藻养殖加工技术已相当成熟，螺旋藻干粉年产近万吨，占世界总产量的50%以上，这为藻蓝蛋白的规模化制备提供了原料基础。

诸多因素影响藻蓝蛋白的提取效果，其中细胞破壁方法、液料比、浸提时间对藻蓝蛋白的提取效果影响较为显著［10］。超声波破壁技术通过微喷射流和超微束作用机制［11］，处理物料破壁率高，目的物质提取效果好，已成为高效提取生物活性物质的必要环节［12，13］。本实验通过响应曲面模型对藻蓝蛋白的超声波提取工艺进行优化，得到藻蓝蛋白的最佳提取条件，并将此法与冻融法、恒温浸提法进行比较，得知超声波提取法用时短、藻蓝蛋白得率高，适用于藻蓝蛋白的快速检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

螺旋藻粉，北海生巴达生物科技有限公司提供;所有化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;水为去离子水。

TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司;DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;KQ2200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;BT125D电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;BCD-209FDG冷藏冰冻箱，青岛澳柯玛股份有限公司;CT15RT高速台式冷冻离心机，上海天美科学仪器有限公司;Design Expert software(Version 8.0.5.0)Stat-Ease Inc.，Minneapolis，America。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分析

称取一定量的螺旋藻粉，加入磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 值7.0，含有0.004 mol/L的叠氮钠)，混匀后超声波处理，离心(15000 r/min，15 min)，吸取1 mL上清液，用磷酸盐缓冲液定容至100 mL，在620 nm与652 nm处测定容量瓶中液体的吸光度，根据下式［14］计算藻蓝蛋白的浓度:

PC，藻蓝蛋白浓度;A620，样品在620 nm处的吸光度;A652，样品在652 nm处的吸光度。

根据下式计算藻蓝蛋白的得率:

Y ，藻蓝蛋白得率;PC，藻蓝蛋白浓度;V，磷酸盐缓冲液体积;n，稀释倍数;DB，螺旋藻粉重量。

1.2.2 优化试验设计

采用三因素的Box-Behnken设计(BBD)优化提取工艺参数。根据单因素试验结果，规定了三个因素的变动范围及中心点值(表1)。BBD有17个析因点，其中有五个重复的中心点(表2)。采用Design Expert软件分析实验数据，求解如下表达式:

Y，因变量即藻蓝蛋白得率;A0、Ai、Aii、Aij，模型系数;Xi，Xj，因素水平。

表1 Box-Behnken设计的因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 不同提取方法的比较

对3种不同藻蓝蛋白提取方法进行比较:冻融法［15］、恒温浸提法［16］、本试验获得的超声波提取法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对藻蓝蛋白得率的影响

超声波功率600W，超声时间14 min，研究不同液料比对藻蓝蛋白得率的影响。如图1所示，当液料比从10 mL/g增大到30 mL/g，藻蓝蛋白得率先升高后下降。当液料比为20 mL/g时，藻蓝蛋白得率最高，为10.72%。曲文娟等也得到相似的实验结果，液料比为20 mL/g时提取效果最好［17］。朱劼等研究结果表明，粉量为溶剂量的5%是最佳的提取参数［18］。本文试验结果与Sivleira等的报道不一致，他们的研究结果表明:液料比为12.5 mL/g时，藻蓝蛋白提取浓度最大［19］。这可能是由于所用螺旋藻原粉性质不同所致。Sivleira等用的螺旋藻粉是将螺旋藻泥放于40℃的烘箱中烘48 h得到的，本试验所采用的螺旋藻粉是螺旋藻泥喷雾干燥所得。

图1 液料比对藻蓝蛋白得率的影响Fig 1 Effect of different ratios of PBS to raw material on extraction yield

2.1.2 超声波功率对藻蓝蛋白得率的影响

液料比20 mL/g，超声时间14 min，研究不同超声波功率对藻蓝蛋白得率的影响。当超声波功率从400W增大到640W时，藻蓝蛋白得率由9.93%升高为10.79%(图2)。超声波功率增大导致细胞膜表面及周围的空化泡破裂［20］，产生大量的微裂缝及孔洞，促进物质转移，藻蓝蛋白溶出量增加。当超声波功率从640W继续增大到800W时，藻蓝蛋白得率逐渐降低。这可能是由于功率的进一步增大，产生的热量无法及时地散去，溶液温度过高引发藻蓝蛋白的结构受到破坏而降解，导致得率下降。朱劼等试验结果表明，超声波功率为630W时，藻蓝蛋白提取效果最好［18］。然而，曲文娟等研究结果为:1400W是最优的超声波功率［17］。

图2 超声波功率对藻蓝蛋白得率的影响Fig 2 Effect of different ultrasonic power on extraction yield

2.1.3 超声时间对藻蓝蛋白得率的影响

液料比20 mL/g，超声波功率600W，研究不同超声时间对藻蓝蛋白得率的影响。当超声时间从10 min延长到14 min时，藻蓝蛋白得率显著提高(图3)。延长超声时间可引发更多的空化泡破裂，更多的溶剂进入细胞，促使物质转移［21］。当超声时间从14 min继续延长，藻蓝蛋白得率下降，可能是产生的热量不能及时散去导致藻蓝蛋白分解。

图3 超声时间对藻蓝蛋白得率的影响Fig 3 Effect of different extraction time on extraction yield

2.2 响应面法优化

采用Design Expert软件对表2的实验结果进行回归拟合，得到藻蓝蛋白得率对三个因素的多元二次回归模型:

表2 Box-Behnken试验设计与试验结果Table 2 Results of Box-Behnken design

从表3二次响应面回归模型的方差分析结果可知，回归模型高度显著(P值＜0.0001)、失拟项不显著(P值 =0.0834＞0.05)、R2=99.95%、R2adj=99.89%、C.V.=0.18，这些数据表明回归方程拟合度和可信度均很高，能很好地对最优工艺条件进行预测。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

表4 回归方程系数显著性检测结果Table 4 Significance of regression coefficients

由回归方程系数显著性检测结果(表4)可知，试验中一次项X1极显著、X2不显著、X3显著;二次项极显著、不显著不显著;交互项均为极显著。

根据Box-Behnken试验结果作响应曲面图，考察拟合的响应曲面的形状，分析液料比、超声波功率、超声时间三者之间交互作用对藻蓝蛋白得率的影响，其响应曲面如图4、5、6所示。

利用Design Expert软件对模型方程求解，得到响应值藻蓝蛋白得率最大值为10.77%时，液料比、超声波功率、超声时间相应值为21.05 mL/g、640.35W、13.93 min。按照模型预测的最优条件，根据实际情况，在液料比为21 mL/g、超声功率为640W、超声时间为14 min的工艺条件下进行验证性试验，得到的藻蓝蛋白得率(10.76±0.087)%(n=3)和预测值吻合较好，表明该模型工艺参数准确可靠，能较好地预测实际情况。

2.3 不同提取方法比较

从图7可知，超声波提取法藻蓝蛋白得率为10.76%，冻融法藻蓝蛋白得率为7.89%，恒温浸提法藻蓝蛋白得率为6.57%。不同方法对螺旋藻细胞壁的破坏程度不同，导致藻蓝蛋白溶出量各异。超声波提取法半天即可完成测定工作，而另外两种方法所需时间较长。

图7 不同提取方法对藻蓝蛋白得率的影响Fig 7 Effect of different extraction methods on extraction yield

3 结论

1)由单因素试验和Box-Behnken试验设计及分析结果得到的超声波提取螺旋藻中藻蓝蛋白的最佳工艺条件为:液料比为21 mL/g、超声波功率为640W、超声时间为14 min，此时藻蓝蛋白得率为10.76%。

2)对不同提取方法进行比较，结果表明，超声波提取法操作时间短、藻蓝蛋白得率高。本方法适用于藻蓝蛋白的快速检测分析。

［1］Eriksen N T.Production of phycocyanin-a pigment with applications in biology，biotechnology，foods and medicine［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，80(1):1-14.

［2］Marx A，Adir N.Allophycocyanin and phycocyanin crystal structures reveal facets of phycobilisome assembly［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics，2012，1827(3):311-318.

［3］Gantar M，Simovic'D，Djilas S，et al.Isolation，characterization and antioxidative activity of C-phycocyanin from Limnothrix sp.strain 37-2-1［J］.Journal of Biotechnology，2012，159(1):21-26.

［4］Murugan T.Antibacterial activity of C-phycocyanin against clinical isolates by disc diffusion method［J］.Journal of Pharmacy Research，2012，5(6):3020-3021.

［5］Gantar M，Dhandayuthapani S，Rathinavelu A.Phycocyanin induces apoptosis and enhances the effect of topotecan on prostate cell line LNCaP［J］.Journal of Medicinal Food，2012，15(12):1091-1095.

［6］Nagaraj S，Arulmurugan P，Karuppasamy K，et al.Hepatoprotective and antioxidative effects of C-phycocyanin in CCl4induced hepatic damage rats［J］.Academic Journal of Cancer Research，2011，4(2):29-34.

［7］Ou Y，Lin L，Yang X，et al.Antidiabetic potential of phycocyanin:Effects on KKAy mice［J］.Pharmaceutical Biology，2013，(0):1-6.

［8］Romay C，Gonzalez R.Phycocyanin is an antioxidant protector of human erythrocytes against lysis by peroxyl radicals［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2000，52(4):367-368.

［9］Antelo F S，Costa J A V，Kalil S J.Thermal degradation kinetics of the phycocyanin from Spirulina platensis［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，41(1):43-47.

［10］Abalde J，Betancourt L，Torres E，et al.Purification and characterization of phycocyanin from the marine cyanobacterium Synechococcus sp.IO9201［J］.Plant Science，1998，136(1):109-120.

［11］Roberts W W.Cavitation:mechanism of histotripsy［M］.Imaging and Focal Therapy of Early Prostate Cancer，Humana Press，2013，331.

［12］Zhong K，Wang Q.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(1):19-25.

［13］Wang Y J，Cheng Z，Mao J W，et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of Poria cocos polysaccharides by response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2009，77(4):713-717.

［14］Bennett A，Bogorad L.Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga［J］.Journal of Cell Biology，1973，58(2):419-435.

［15］张薇君，郝纯彦.出口螺旋藻粉中藻胆蛋白测定方法的研究［J］.光谱仪器与分析，1999，3:8-11.

［16］Yoshikawa N，Belay A.Single-laboratory validation of a method for the determination of c-phycocyanin and allophycocyanin in Spirulina(Arthrospira)supplements and raw materials by spectrophotometry［J］.Journal of AOAC International，2008，91(3):524-529.

［17］曲文娟，马海乐，张厚森.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术［J］.食品科技，2007，32(5):135-139.

［18］朱 劼，董文杰，刘 佳.超声波协同等电点沉淀法提取螺旋藻藻胆蛋白工艺的优化［J］.食品科学，2010，31(10):146-150.

［19］Silveira S T，Burkert J F M，Costa J A V，et al.Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design［J］.Bioresource Technology，2007，98(8):1629-1634.

［20］Vinatoru M.An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2001，8(3):303-313.

［21］Chandrapala J，Oliver C M，Kentish S，et al.Use of power ultrasound to improve extraction and modify phase transitions in food processing［J］.Food Reviews International，2013，29(1):67-91.