雷世勇，丁理法，黄福勇，竺俊全

(1.宁波大学教育部应用海洋生物技术重点实验室，宁波315211;2.温岭市水产技术推广站，浙江温岭317500)

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)属星虫动物门、革囊星虫科、革囊星虫属，自然分布于浙江、福建、广东、广西和海南等省沿海。可口革囊星虫栖息于潮间带泥质或泥沙质滩涂，营穴居生活，以底栖硅藻和有机腐殖质为食。由于其风味独特、营养经济价值及药用价值较高［1-3］，且生长快、利用自然苗种养殖一年便能收获，因此，是非常理想的优良增养殖种。近年来由于沿海环境污染的加剧以及过度采捕，加之大面积滩涂被围垦，减少了星虫的栖息地，造成资源的严重衰退。因此，可口革囊星虫的资源保护、人工育苗与增养殖引起重视［4］。迄今，有关可口革囊星虫的基础研究已经涉及到了营养学［2，3］、繁殖生物学［5-9］、分子生物学［10-12］等方面。同工酶技术作为一种成熟的实验手段，已在动物的生化遗传和遗传多样性等多方面的研究中得到广泛应用。本研究用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对可口革囊星虫5种组织中的10种同工酶进行了检测分析，以了解可口革囊星虫基因表达的特异性，为进一步研究可口革囊星虫的遗传多样性、各组织的生理机能以及种质鉴定提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验用可口革囊星虫采自浙江省温岭市坞根镇潮间带滩涂，挑选活力好、健壮的成体，个体重2.5～3.5 g，每种同工酶检测均取30条。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

活体解剖可口革囊星虫，取吻、肠和体壁组织各0.3 g，收吻肌和肾管取全部，用生理盐水清洗后，加重蒸水600 μL，4℃冰浴匀浆，移入离心管，15 000 r/min离心15 min，取上清液，按1：1的比例加入40%甘油和0.1%溴酚蓝指示剂，用于电泳分析。

1.2.2 电泳、染色

同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳法，分离胶浓度为6.7%，浓缩胶浓度为2.5%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸(TG，pH值8.3);采用DYY-2C型稳压稳流电泳仪，DYCZ-24D型垂直板电泳槽;用25 μL微量进样器点样，每空点样量为15 μL，然后，将电泳槽移至4℃冰箱中进行电泳。电泳时，指示剂在浓缩胶内时用150 V电压，当指示剂完全进入分离胶后，将电压升高到180 V，总电泳时间约4 h。凝胶制备及染色参照文献［13］。

1.2.3 结果记录与酶谱分析

凝胶用7%醋酸溶液脱色固定后进行酶谱分析，利用FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统观察、拍照，对凝胶测量后按酶带迁移率手工记录。各位点命名以各酶谱的相对Rf迁移率由小到大依次命名，即向阳极运动的酶谱带开始依次命名为1，2，3……，Rf=l/L，l为阴极端至各谱带中点的距离，L为阴极端至指示剂终点的距离。

2 结果

5种组织中的同工酶谱及活性强弱见图1及表1。

2.1 醇脱氢酶(ADH，E.C.1.1.1.1)

肠组织中没有检测到有活性的ADH同工酶酶带;吻中ADH同工酶由4个基因座位编码，ADH-1活性较强，ADH-2、ADH-3、ADH-4活性较弱;ADH-1在收吻肌、吻、肾、体壁中均表达且活性较强;ADH-2只在体壁中表达、活性较弱。

2.2 D-葡糖脱氢酶(GCDH，E.C.1.1.1.118)

GCDH同工酶在收吻肌中有1条谱带，活性很强;在吻中有5条谱带;在肠中不显示有活性的谱带;在肾管中只有1条谱带，活性弱;体壁中有2条谱带。

2.3 山梨醇脱氢酶(SDH，E.C.1.1.1.14)

SDH同工酶在收吻肌中显示有SDH-1、SDH-2两条谱带，在其它4种组织中只有一条谱带。SDH-2在肠中酶活性强。

2.4 酯酶(EST，E.C.3.1.1.1)

EST同工酶酶谱较复杂，在5种组织中均有表达。EST-1仅在收吻肌中表达，活性强;EST-2在收吻肌、吻及体壁中表达，收吻肌中活性强;EST-3在5种组织中均有表达，肠与肾中活性强;EST-4只在肾管中表达，活性强;EST-5在肠和体壁中表达，活性强;EST-6和EST-7在吻和肠中表达，吻中活性弱、肠中活性强;EST-8和EST-9在吻和体壁中表达，且EST-9的活性强;EST-10只在吻中表达，活性强;EST-11在除肾管外的4种组织中均有表达，活性弱;EST-12在收吻肌、吻和肠中表达活性较弱。

图1 可口革囊星虫同工酶电泳图谱Fig 1 Electrophoretic patterns of isozymes on Phascolosoma esculenta

2.5 乳酸脱氢酶(LDH，E.C.1.1.1.27)

LDH同工酶在收吻肌中仅有LDH-1和LDH-4两条酶带，LDH-1活性强;在吻中有5条酶带，LDH-4活性强;在肠和肾管中只有LDH-4一条酶带，且活性弱;体壁中有4条酶带，LDH-4活性强。

表1 可口革囊星虫5种组织中9种同工酶的表达和活性Table 1 The expression and activity of 9 isozymes in 5 tissues of Phascolosoma esculenta

2.6 苹果酸酶(ME，E.C.1.1.1.40)

ME同工酶具有复杂而清晰的酶谱。ME-1仅在吻中存在;ME-2、ME-3和 ME-4在5种组织中均存在，ME-2在收吻肌、吻及体壁中活性强，而在肠和肾管中活性较弱，ME-3、ME-4在5种组织中活性强;ME-5和ME-6仅在吻和体壁表达。

2.7 过氧化物酶(POD，E.C.1.11.1.7)

过氧化物酶共有2条酶带，其中POD-1仅在吻中表达，但活性较弱;POD-2在吻、肠、肾管及体壁中表达，肠和肾管中活性较强。

2.8 超氧化物歧化酶(SOD，E.C.1.15.1.1)

SOD同工酶仅有一条酶带，SOD酶带在5种组织中均有表达，在收吻肌中活性弱，在其它组织中活性强。

2.9 苹果酸脱氢酶(MDH，E.C.1.1.1.37)

MDH同工酶有电泳移动较快的s(胞质型)-MDH和移动较慢的m(线粒体型)-MDH两种类型，m-MDH靠近阴极，s-MDH靠近阳极。m-MDH由一个基因座位编码，s-MDH由s-MDH-1和s-MDH-2两个基因座位编码，互相之间不杂合，其中s-MDH-2在各组织中活性很强。

3 讨论

在所检测的10种同工酶中，除CAT没有检测到酶活性外，其它9种同工酶得到了相应的酶谱。从图1和表1可以看出，从同工酶酶谱的表型来看，SOD和MDH在各组织中的表型较为一致，SOD由一个基因座位编码，在收吻肌中活性较弱，在其它4种组织中活性较强，MDH由3个基因座位编码，3个基因座位(m-MDH、s-MDH-1和s-MDH-2)在5种组织中均有表达，除m-MDH在5种组织中的活性有差异外，s-MDH-1和s-MDH-2在5种组织中活性都很强。在可口革囊星虫的5种组织中，SDH-2、EST-1、LDH-1及 POD-1为收吻肌所特有;ADH-3、ADH-4、GCDH-2、GCDH-4、GCDH-5、EST-10及LDH-6为吻所特有;EST-4为肾管所特有;在肠中，ADH和GCDH均没有检测到活性。不同组织中同工酶表达的差异是受不同的遗传基因控制的结果，以适应各组织器官不同的生理需要。

同工酶在生物体各组织中的表达、分布及活性与各组织的生理机能密切相关。如酯酶和食物的消化有密切关系，同时还有解毒的作用［13］;醇脱氢酶、D-葡糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸酶和能量的产生有密切关系［14-17］;过氧化物酶和超氧化物歧化酶和机体的防御机能密切相关［18］。

可口革囊星虫的5种组织具有较为丰富的酶系统，它们以同工酶的形式参与机体的代谢和调节。收吻肌的运动需要大量的能量，与此相适应，收吻肌中D-葡糖脱氢酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶表现出较强活性;吻中D-葡糖脱氢酶、酯酶、乳酸脱氢酶、苹果酸酶、超氧化物歧化酶和苹果酸脱氢酶均有表达，且大多具有复杂酶谱并表现出较强活性，这不仅与吻作为星虫动物重要运动器官、需要大量能量供应相适应，还说明它可能对摄取的食物进行初步消化，并担负着机体防御的功能;肠中，有些酯酶活性强，超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性较强，说明肠除了担负消化功能之外，还起着解毒和防止氧化损伤等作用［14］;体壁运动耗能多，苹果酸酶和苹果酸脱氢酶活性强，因机体防御机能的需要，有些酯酶和超氧化物歧化酶活性也较强。可口革囊星虫为低等无脊椎动物，各组织功能的分化程度较低，收吻肌、吻及体壁在机体运动中相互配合，吻、肠、体壁同时在完成机体的防御功能中担负重要使命，吻和肠还具有消化、吸收的功能，这从同工酶酶谱中得到了很好反映。

［1］蒋定文，沈先荣，贾福星，等.海洋星虫提取物的营养分析及免疫调节作用的初步观察［J］.中国生化药物杂志，2004，25(2):96-97.

［2］周迎松，丁理发，徐继林，等.可口革囊星虫主要营养要素的分析［J］.营养学报，2007，29(4):413-414.

［3］周迎松，严小军，李广宇，等.可口革囊星虫多肽在运动中抗自由基作用的实验研究［J］.中国运动医学杂志，2008，27(1):55-60.

［4］徐敏娴，丁理法，周敏华.可口革囊星虫人工繁育及增养殖技术的研究［J］.水产养殖，2011，32(11):39-41.

［5］竺俊全，王 武，许式见，等.可口革囊星虫的精子发生及精子结构［J］.动物学报，2007，53(4):733-741.

［6］竺俊全，王 武，应雪萍，等.可口革囊星虫受精过程及早期卵裂的细胞学变化［J］.动物学报，2008，54(2):290-298.

［7］金春华，竺俊全，许式见，等.可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)胚胎及幼虫发育研究［J］.海洋与湖沼，2011，42(1):94-100.

［8］顾晓英，竺俊全，许式见，等.可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)卵子发生的组织学研究［J］.海洋与湖沼，2009，40(3):283-288.

［9］竺俊全，王 伟，丁理法.可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)卵黄合成期卵母细胞发育及卵黄发生与卵膜形成的超微结构［J］.海洋与湖沼，2012，43(3):1-7.

［10］王孟前，李 晔，苏秀榕，等.可口革囊星虫cDNA文库的构建及蚯蚓血红蛋白基因序列的分析［J］.台湾海峡，2010，29(1):20-26.

［11］Su X R，Du L L，Li Y Y，et al.Cloning and expression of HSP70 gene of sipuncula Phascolosoma esculenta［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2010，28(3):461-466.

［12］Wang M Q，Su X R，Li Y，et al.Cloning and expression of the Mn-SOD gene from Phascolosoma esculenta［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology ，2010，29(5):759-764.

［13］胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用［M］.长沙:湖南科学技术出版社，1985.86-126.

［14］李太武，苏秀榕.中国对虾和日本对虾6种同工酶的比较研究［J］.海洋学报，1997，19(2):85-88.

［15］张锦芳，籍小涛，杜连祥.D-葡萄糖脱氢酶活力测定方法的研究——短小芽孢杆菌在D-核糖生产中的应用［J］.天津轻工业学院学报，2001，38(3):37-40.

［16］任雪峰，陈载融，孙春洪.连续监测法测定血清山梨醇脱氢酶［J］.临床检验杂志，1997，15(2):76-79.

［17］李广丽，朱春华.月鳢不同组织中乳酸脱氢酶和酯酶同工酶的比较［J］.湛江海洋大学学报，1999，19(1):1-3.

［18］方允中，李文杰.自由基与酶［M］.北京:科学出版社，1989，111-133.