刘杰昌，王 莹，黎建至，黄汗青，欧辉超

(暨南大学生命科学与技术学院，广州510632)

对于研究野外动物生活习性来说，了解其食性是很关键的一环。只有了解动物的食性才能研究该动物在食物链的地位、适应环境的能力和了解环境中物种的变化等。并且可通过动物的食性了解其营养状况，有利于珍稀物种的研究保护［1］。

研究动物的食性有几种方法，一种是直接观察。但是如果要研究活动范围大的动物［2］所耗费的时间会很多。而且环境中的物种组成复杂也会增加检测时的难度。第二种是通过动物的肠道内容物研究其食物组成［3］，这种方法广泛应用在野外，但不适用于濒危动物的研究，尤其在复杂的环境中相比直接观察更有效率。还有一种方法是利用动物的粪便研究食物组成，有时候对于研究珍稀动物或者是分布稀疏的动物来说，粪便的收集往往比肠道物收集来得容易，而且对动物的干扰更小［4］。

利用粪便研究动物食性的技术具有收集方便，对动物干扰小等优点。目前国内外有几种惯用的以粪便为基础的技术。例如利用显微技术分辨出粪便中微植物组织，但是这种方法由于有时候因为粪便中存在着比较多种的植物碎片导致了错认和漏认［5］，而且往往需要研究人员具备专业的植物形态学分类知识和掌握大量的植物种类特征。利用碳氮稳定同位素检测动物食性在之前是一项比较流行的研究方法，虽然这项技术能够定性定量检测出动物中的食物组成［6］，但如果要研究食性广泛的动物这项技术会有很大的限制［7］。

而随着分子生物学技术的发展，以DNA条形码技术为基础的研究逐渐成为一种非常有前景的方法，它利用一段DNA序列来作为检测各物种的标记［8］，物种［9］和环境样本［10，11］都能通过 DNA 条形码技术来确认其分类学上的关系。理想的DNA条形码应该是一段标准、稳定、尽量短但是又能表现出种间差异。但是到现在还没有找到一条符合各个标准的DNA条形码，于是研究学者会根据研究的目的而对标准有所侧重。例如分类学家会首先考虑DNA条形码是否标准，包含足够的系统发生学信息。而生态学者会考虑DNA条形码是否稳定和容易从环境材料中扩增降解的DNA。实验中所研究的rbcL-a序列是质体编码Rubisco大亚基，简称 rbcL基因(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase large subunit gene)的一部分，最早由Poinar提出并应用于粪便中植物物种检测。它全长只有157 bp，具有从高度降解的环境样本中扩增出DNA序列段的能力［12］。本研究模拟野外样本的检测方法，利用rbcL-a序列检测小白鼠粪便中的植物物种，初步探究rbcL-a序列应用于小鼠粪便中植物物种检测的效果。

1 材料与方法

1.1 模拟环境样本的收集

小白鼠是实验中经常用到的材料，且小鼠对食物并没有特殊的偏好和厌恶，正好用来作为本次实验的研究对象。本研究从动物房中买来16只小白鼠，分成2组，每组8只。由于小白鼠体型较小，要收集足够实验的粪便的量需要大量的时间，而且为了使粪便都来自同一个时间段，本研究把每组8只小白鼠的粪便收集在一起。挑选6种植物(表1)对小白鼠进行饲养，考虑到小白鼠的体型较小，食量较少，本研究把6种植物分成2份。在前两天的中午和晚上，按时定性定量喂给小白鼠第一组植物(花椰菜、小麦、生菜)，然后，为了防止食物跟粪便粘连，在第3 d的傍晚清理粪便并不再喂食。到第4 d的早上收集粪便，粪便用1.5 mL的离心管装好，写上日期，得到了A组和B组粪便样本，样本直接放到-20℃冰箱中保存直至DNA提取。喂食小白鼠第二组植物(白菜、玉米、胡萝卜)并按照第一组的流程进行，在饲养结束后得到了C组和D组粪便样本。

表1 实验所用的6种植物学名及分类Tab 1 Botanical names and classification of 6 plants used in the experiment

1.2 粪便DNA提取及扩增

收集的4组粪便样本，用液氮研磨成粉状。利用OMEGA公司所提供的HP Plant DNA Mini Kit试剂盒进行总量DNA提取，方法步骤遵循着说明书的指引。为了消除粪便中腐植酸、酚类化合物对后面试验的影响，在步骤中加入OMEGA公司的HTR Reagent去除粪便中的污染物。PCR反应在50 μL的总量进行:2 μL DNA 模板，2 mM MgCl2，0.05 mg BSA，250 μM dNTPs ，200 nM primer，1 U Taq酶和1×PCR buffer。PCR 反应所用试剂为Takara公司产品。rbcL-a序列的正向引物:5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-'3，反向:5'-CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG'-3。rbcL-a序列与PCR反应条件参照Poinar［12］的研究。

1.3 PCR回收、克隆与测序

PCR产物利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京华大蛋白质研发中心有限公司)进行DNA回收，利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector试剂盒进行TA克隆连接。已连接的载体转化到制备好的DH5α感受态细胞中，经过蓝白斑筛选后，挑取单菌落制成菌液，送去上海生工生物工程有限公司使用ABI-PRISM3730测序仪进行单向测序。

1.4 序列分析

测序得到的序列利用ClusterX［13］软件进行完全比对。由于A组和B组粪便中食物组成是一样的，C组和D组同上，所以把它们两两结合起来比对。比对中出现3次或3次以上的序列称为共有序列［14］，出现的共有序列会进行下一步的物种分析。如果某一序列假设为A序列，在样本中出现1～2次，并跟共有序列比对只出现1个碱基的差异，我们认为这是共有序列在测序时发生错误产生A序列，不进行下一步的物种分析。但是只出现1～2次，与共有序列比对有2个或2个以上的碱基差异的序列我们排除这是测序发生的错误，并进行下一步的物种分析。

所有得到的共有序列与达不到共有序列的条件，但也排除了测序错误可能的序列的物种分析利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)［15］，将序列与GenBank数据库中植物序列进行比对。在惯有的比对标准，要使序列与物种匹配，序列与物种序列的相似度要达到98%以上和100%的序列覆盖率［16］。为了缩小筛选范围，我们把相似度提高到99%以上。如果序列能够跟两个或者更多的物种匹配，则把序列分配到包含所有匹配的物种的更高分类单元上［14］。与序列匹配的物种中如果含有序列相似度达到100%的物种，则不考虑相似度为99%的物种。

为了鉴定到更精确的分类单元，我们提取实验中用到的6种植物DNA并进行rbcL-a序列的PCR扩增，得到的PCR产物直接送到上海生工生物工程有限公司进行TA克隆测序(每种植物都挑取10个单克隆进行测序)。所有从粪便样本得到的序列都会与得到的6种植物rbcL-a序列进行比对。如果序列与某种植物rbcL-a序列的相似度和序列覆盖率都达到100%，则认为该序列属于此植物物种。

2 结果与分析

本研究从4组粪便中共得到130条序列(每组31～36条)，在物种分析中除了排除低于标准(覆盖率100%与99%以上相似度)的序列，我们还发现了与序列相匹配的物种序列描述是位于线粒体中的编码Rubisco大亚基假基因或者是线粒体基因。这种情况可能是因为植物线粒体中也存在着rbcL基因，出现实验中扩增了线粒体rbcL基因或者与rbcL基因相似的假基因的现象。凡是有与线粒体基因匹配的序列我们都认为是引物扩增了错误序列并排除［17］。

在扩增6种植物rbcL-a序列中我们得到了5种植物的PCR产物，但是并没有发现玉米的PCR产物，这在C组、D组的序列比对中同样没有找到与玉米种属关系相近的序列。5种植物的PCR产物经测序得到的序列与GenBank物种序列进行比对，在排除了假基因序列与覆盖率、相似度不符合本实验标准的序列，得到了生菜、花椰菜、胡萝卜和白菜物种的唯一序列。序列已提交到日本DNA数据库DDBJ(DNA Data Bank of Japan)。编号为:AB711139-AB711142。小麦 PCR产物经测序得到两条序列，这两条序列互相比对发现其相似度只有98%(覆盖率100%)，与GenBank序列比对中其分类单元都归属到禾本科。

各组粪便样本得到的序列利用GenBank数据库比对所匹配的分类单位在表2中。序列所属的分类单元大部分都归属到科，其中D组出现了属的分类单元。序列与测序得到5种植物rbcL-a序列进行比对，发现花椰菜、胡萝卜和生菜物种的rbcL-a序列分别有序列与之相似度达到100%，这三条待分析序列分别对应着表2中A、B、C、D组的十字花科、D组的伞形科和芸薹属。

表2 利用BLAST软件检测到的植物分类单位(括号为该分类单元序列与5种植物rbcL-a序列比对所匹配的植物物种)Tab 2 Plant taxa detected with BLAST program(plant species in the brackets were belonged to the taxa sequence which was matched to 5 plant species of rbcL-a sequences

有趣的是，A组与B组鉴定到十字花科的序列与C组、D组鉴定到十字花科的序列的相似度为100%(覆盖率100%)，也就是说，C组与D组中也出现了花椰菜的序列。花椰菜与白菜同属十字花科芸苔属，两植物物种测序得到的序列显示花椰菜与白菜的rbcL-a序列只相差一个碱基，但是两种植物在挑取单克隆测序得到的序列并没有出现相互混杂的情况，也就排除了在生菜物种中扩增出能与花椰菜物种匹配的序列的可能性。根据实验中植物分组的情况，C组与D组出现的十字花科序列有可能是其粪便中残留有花椰菜碎屑，但这需要进一步的实验说明。

在A组与B组的序列中我们发现有序列能够匹配到禾本科的分类单元，但是与得到的两条小麦rbcL-a序列比对其覆盖率与相似度并没有达到实验中要求的标准。不能确定是否得到了正确的小麦rbcL-a序列。鉴于之前的实验我们并没有得到玉米物种的PCR产物，我们认为rbcL-a序列可能不适用于检测禾本科物种。6种植物rbcL-a序列测序中虽然得到了生菜rbcL-a序列，但是样本A组与B组的序列中我们并没有发现与生菜科属有关的序列。这可能是在饲养过程中小白鼠并没有把生菜当做食物(即使在清理笼子里的粪便时我们只发现了生菜的碎片)，只当作磨牙用。

3 讨论

本实验利用rbcL-a序列结合分子克隆对小白鼠粪便进行物种检测，具有操作简单、快捷等特点。测序得到的130条序列利用GenBank数据库比对鉴定出3科和1属。与单独扩增测序得到的5种植物的rbcL-a序列进行比对，发现有待分析序列与花椰菜、白菜和胡萝卜物种rbcL-a序列的相似性达到100%(序列覆盖率100%)，分别确定其为花椰菜、白菜和胡萝卜物种的序列。实验结果表明利用rbcL-a序列模拟检测小鼠粪便中的6个植物物种大部分能够鉴定到科甚至属的分类单位。通常野外植食性动物或者是杂食性动物食物来源广泛，如果所研究的野外动物的食物来源不是太局限于某一个植物的科属的话，利用rbcL-a序列应用到野外动物粪便中的植物物种检测还是能够取得很好的效果。

rbcL-a作为检测野外样本中的植物物种的条形码工具还是具有其独特的优势。只有157 bp的长度使它容易从环境样本中扩增出DNA序列。虽然它的进化速率不是很高［18］，在实验中它难以区分科以下的分类单位。但是如果能够建立一个所研究的当地植物物种的序列库［19］与待分析序列进行比对(类似本实验的研究方法)，则能够使待分析序列匹配到一个更低的分类单元。

在实验中，我们发现粪便对样本中的残留植物DNA影响较大。相比于直接提取植物DNA扩增得到的rbcL-a序列比较单一且稳定，从粪便中提取并扩增出来的序列具有很大的多样性。除了扩增出线粒体假基因(这种情况在扩增6种植物rbcL-a序列段也同样存在)以外，也出现了很多在GenBank中找不到相似物种的序列，或者是扩增了质体中的其它序列段。在C组的测序结果中，其大部分序列都由一种单一共有序列构成，且这段序列在GenBank相似度比对中显示的是植物质体的trnL基因，这也是C组与D组重现性不好的原因。幸好在技术方面，高通量、大规模测序已逐渐成为一股新的力量推动着DNA条形码技术高速发展［20］，有利于弥补扩增和测序错误等缺点，也节省了大量的时间(重复挑取单克隆的效率不高)。而随着利用植物DNA条形码对野外样本的物种研究的深入，还有很多DNA条形码像rbcL-a一样投入这方面的研究，例如p6 loop序列［16］。相信在不久的将来，研究者在利用植物DNA条形码对野外样本的研究会取得更加瞩目的成果。

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