王美玲，吴茜茜，蔡敬民，

(1.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥230036;2.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥230601)

从孟德尔的遗传规律到Watson-Crick DNA双螺旋结构的发现，再到人类基因组计划和植物基因组计划的实施，其研究从细胞染色体水平深入到DNA大分子水平，再进入反向生物学阶段。1920年，Winkles［1］提出了genome，由 gene和chromosomes两个单词组合而成，表明生物信息是由基因和染色体组成。随着生物科学的迅速发展，生物学家们对基因组DNA研究的中心任务由一个或少数几个基因逐步转向整个基因组结构以及功能的研究，基因组文库应运而生。通过几十年的发展，基因组文库为开展基因组的分化组成、基因的表达与调控、染色体区段的分子物理作图等领域的研究和基因的克隆提供技术平台。

1 基因组文库的分类

基因组文库种类繁多，按插入片段的大小可将其分为小于100Kb的小片段基因组文库(cosmid、fosmid等)和100Kb及其以上的大片段基因组文库(BAC、YAC等)。同时基因组文库按其载体种类大致可分为噬菌体系列，如早期的λ噬菌体、cosmid、P1噬菌体和fosmid等;20世纪80年代起构建的人工染色体系列，如YAC、BAC等，及在此基础上构建的多元载体BIBAC和TAC。几种克隆载体性质的比较见表1。

2 噬菌体系列

2.1 λ噬菌体文库

λ噬菌体是噬菌体改造成载体中应用最为广泛的，是基因组大小约49 Kb的线性双链DNA噬菌体。DNA双向复制机理的揭示、转录终止和抗终止作用蛋白质的分离、DNA连接酶和促旋酶的发现和SOS修复机理的阐明等，都是以λ噬菌体为材料做出的重要成果。λ噬菌体是基因组文库构建中使用较早的载体，插入片段理论极限为23 Kb，虽容载有限，但为进一步构建大片段插入文库奠定了基础，许多cDNA文库也是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。例如，李南羿等以λGEM-11为载体构建了草菇基因组文库;张洁［2］等成功构建重组率为100%的藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库;朱靖［3］等针对λ噬菌体cDNA文库效率低下、筛选等问题，利用λTripEx2噬菌体能自身环化成质粒pTripEx2的原理将λ噬菌体cDNA文库转化成质粒cDNA文库;尚毅［4］等用液体分装代替涂板分区改进了基于PCR的筛库方法，提高了筛选速度和效率，实现了cDNA文库的功能性筛选。

表1 克隆载体的种类及特点Table 1 The types and characteristics of the cloning vector

2.2 cosmid文库

1978年，Collins等人构建了柯斯质粒载体，仅以λDNA两端包装噬菌体必需的cos序列，加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等构成，因此具有λ噬菌体和质粒的特点，在宿主细胞内以λ噬菌体DNA同样的方式环化，与其他大肠杆菌宿主载体系统(BACs等)相比操作简单［5］。Cosmid文库插入片段极限可达45 Kb，已广泛应用于植物遗传、基因克隆、测序和图谱制作等研究中。彭开蔓和张启发构建了优良水稻品种“明恢63”基因组的cosmid文库;易厚富等构建水稻广亲和品种核DNA cosmid文库并分离得到一个位于水稻广亲和基因座S5附近的克隆R2I19;李敏等构建了蜘蛛基因组DNA cosmid文库并克隆了拖丝蛋白基因;安洋［6］等致力于研究红色红曲霉基因组cosmid文库大片段DNA的制备;王雅丽［7］等构建了小球藻南极株和温带株基因组的cosmid文库。但cosmid和λ噬菌体文库很难完成大量叠连序列的组装及哺乳动物基因组物理图谱的构建，从而限制了它的应用。

2.3 P1噬菌体文库和PAC文库

1990年能高效扩增较大基因组片段(90-100Kb)P1噬菌体文库被研制出来［8］，P1噬菌体的生物学特性、与黏粒相似的原理、装备的标记基因等辅助原件，使得文库能涵盖哺乳动物基因组。在P1噬菌体文库的基础上，1994年Ioannou等将噬菌体P1和F因子系统相结合构建了PAC文库。PAC文库通过电激穿孔导入而非像P1噬菌体文库一样通过包装或特异位点重组的方式导入大肠杆菌，其插入片段为100-300 Kb。P1噬菌体文库与PAC文库都没有明显的嵌合和缺失现象，有较高的遗传稳定性，能高效扩增，外源DNA易分离。Gingrich等构建了人类第二条染色体的PAC文库;日本水稻基因组计划(RGP)已将水稻的PAC文库用于物理图谱的构建［9］。

2.4 fosmind文库

1992年，Kim等用 BAC载体的前体 pBAC引入pUCcos改造cosmid载体，使其成为能够稳定搭载大小约45 kb DNA片段的fosmid载体。Fosmid是现在流行的构建文库的新载体，构建时不采用限制性酶切，从而避免了酶切位点的偏好性，拷贝数低且复制稳定，插入片段大小适中，筛选方便等特点使得fosmid文库广泛地应用于基因的位图克隆、物理图谱的构建和比较基因组学中。近年来使用fosmid构建文库的研究不断增多，如土壤环境;红曲菌、鳗弧致病菌［10］等微生物;白菜［11］、对虾［12］等动植物;Beta-Lactamase Gene、Opp 基因簇等具有研究意义的基因。樊帆［13］等基于Illumina公司的测序平台，使用标签和标签接头，成功构建了高通量低成本的fosmid文库;赵心清等通过构建fosmid文库筛选获得一种海洋链霉菌卤化酶基因及其修饰产物的生物合成基因簇。

3 人工染色体系列

3.1 YAC文库

YAC是最早发展的真正意义上的人工染色体，插入片段理论上可达2 Mb左右，能覆盖完整的基因组。YAC最初由Murray等人提出并首次构建55 kb包括着丝粒、端粒、复制子和外源DNA的YAC，美国华盛顿大学Burke等人首先完成了人类基因组的YAC文库。YAC简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程;能构建大的人类基因区段;为真核生物DNA提供了更合适的环境，能够克隆某些在细菌中不能克隆的DNA区段，是分离和制备人类染色体图谱应用最多的体系。人类已建成“百万碱基级”YAC文库，X、Y、21号染色体YAC文库等，相继获得、分离和分析了乳腺癌基因、囊性纤维变性基因等人类基因。小鼠、拟南芥、水稻等模式生物YAC文库已构建和使用，番茄、桑蚕等经济作物和功能基因(免疫球蛋白k链基因)的YAC文库已建立，还进一步对YAC本身进行改良研究［14］。

3.2 BAC文库

1992年Shizuya等构建了第一个BAC载体pBAC108L，开创了BAC文库的纪元。BAC文库插入片段约300 kb，转化率高，遗传稳定，几乎不存在嵌合现象等特点成为近几年应用最广泛的大片段基因组文库。多种植物(包括大多数重要农作物)、微生物、动物甚至线粒体等细胞器的BAC文库已构建使用，从传统的水稻、小鼠等模式生物到稀有的或有研究价值、经济价值的物种;从构建整个基因组到对部分基因的深入探索，从水生到陆生，从简单到复杂。如国内外学者对扬子鳄、食蟹猴［15］、芜菁［16］、链霉菌［17］等展开研究并获得一定的成果。BAC对整个分子生物学的发展作出了巨大的贡献，对基因克隆和基因资源的保存起着重要的作用，但是现在高通量测序技术降低了BAC文库的利用率，夏正俊等建立了无网格BAC文库及其阳性克隆筛选的方法，解决了现有无网格BAC文库程序复杂、费时、假阳性等问题。高海燕等首次通过非暗培养构建了棉花BAC文库，简化了构建工序，节约了材料用量，这一方法适用于所有棉花种。

3.3 MAC文库

哺乳动物人工染色体(MAC)的构建和使用在多年前曾被认为是极端的理想主义，但YAC的研究成功及人类基因组YAC文库的构建，对构建MAC是一个极大的鼓舞。MAC能容纳大于1000 Kb的外源DNA，能为大而复杂的基因提供自主复制的转移载体，甚至能精确提供有丝分裂和减数分裂所需的染色体，因此可用于哺乳动物细胞中染色体功能的研究和体细胞基因治疗［18］。MAC的基本元件包括复制起点、端粒和着丝粒。哺乳动物染色体的复制起点不只一个，一条染色体上可能有多个复制起点，且长短不等，这些都增加了对其分离和结构与功能研究的难度。端粒可能参与间期细胞核三维结构的建成并保证染色体末端的稳定复制，目前已被分离出。而着丝粒的分离要困难得多，着丝粒对于染色体在有丝分裂中的精确定位和分离起重要作用。人的着丝粒大且复杂，Y染色体着丝粒包括大量串联重复的αDNA(24-1600 Kb)，两侧还排列着一些微卫星和局部重复顺序。近年来在阐明着丝粒功能，克隆着丝粒DNA以及分离跟着丝粒功能有关的蛋白等方面已经取得了不少进展。

3.4 HAC文库

HAC即人类人工染色体，第一个有丝分裂稳定的人类人工染色体是由克隆的人类α卫星DNA和端粒序列及其他基因组DNA转染HT1080纤维肉瘤细胞获得的。1998年Ikeno等人用构建YAC的方法来构建HAC:21号染色体上的100 Kb左右的人类I型α卫星DNA(α-21-I)被克隆到YAC载体并翻新了人类着丝粒的序列。HAC大小为1-5 Mb，原位杂交显示插入环状DNA发生多聚化是普遍的并确定HAC不需要宿主细胞末端着丝粒的DNA序列来促使游离基因修复成有丝分裂稳定的DNA［19］。HAC在研究转基因和基因组功能方面是潜力载体，在克隆、操纵和转移大片段基因组时具有稳定性，目前主要应用于基因治疗和干细胞研究。随着人类人工染色体的发展，大片段基因组导入哺乳动物细胞仍被高分子DNA的制备和低拷贝新生HAC的结构所限制。到目前为止，仅有少数报导过大片段基因组成功包裹进新生的HAC中。

4 第三代人工染色体

4.1 BIBAC文库

1996年，Hamilton等结合BAC和根癌农杆菌Ti质粒的特点，构建了一种能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制的“双元”BAC载体BIBAC。BIBAC具有植物选择标记、能够直接转化植物、重组子筛选便利、转化率和克隆效率较高。1999年Hamiton等构建了西红柿的BIBAC文库，随后拟南芥、药用野生稻、香蕉等的BIBAC文库也被相继构建，其克隆片段在不同农杆菌中的遗传稳定性、载体DNA的高效制备等相关方面也有一定的研究。程在全［20］等发明了BIBAC基因文库混合池及混合池和基因的快速筛选方法，并成功构建水稻渗入系以便快速、准确的发掘优良基因。

4.2 TAC文库

刘耀光等人结合PAC和双元载体的特点的建立起了可转化载体系统TAC，构建了pYLTAC7。在此基础上发展起来的系列载体如pYLTAC17以水稻肌动蛋白ActⅠ为强启动子，bar基因为植物选择标记基因，适合禾本科作物转化体的选择;pYLTAC27以Act iv为启动子，hpt为筛选标记基因，可以高效应用于单子叶植物的基因图位克隆及功能分析。目前已经构建了拟南芥、水稻、金鱼草、稻瘟菌［21］等的 TAC 文库，并应用TAC文库分离及克隆出多个功能基因;或构建同一种属的不同物种的文库来比较其基因差异并利用文库研究资源的遗传保护。

5 展望

基因组文库是研究基因的重要工具及手段，克隆载体系统和基因组文库的发展推动基因组学及相关学科如遗传学、分子生物学等的发展。质粒和噬菌体文库的产生和发展为后续人工染色体系列文库的产生和发展奠定了基础;cosmid和fosmid文库增加了容载大小;YAC文库的产生不仅弥补了容量小的缺点，还解决了真核生物表达的许多问题;BAC文库弥补了YAC文库稳定性差和嵌合现象，并以构建方便和操作简单成为了基因组研究应用最广泛、最主要的克隆工具;MAC和HAC文库大片段转化哺乳动物染色体的能力具有广泛的研究前景;BIBAC和TAC文库的发展，标志着基因多元化载体的研究，不仅加速了植物基因组研究、图位克隆和功能分析，还对多基因转化系统的发展起了肯定的作用，对植物基因工程具有重要意义。多基因转化系统将会成为今后基因工程的重点，未来是多基因工程的时代。

［1］解 涛，梁卫平，丁达夫.后基因组时代的基因组功能注释［J］.生物化学与生物物理进展，2000，27:166-170.

［2］张 洁，孙秀珍，颜 虹，等.藜草花粉变应原噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定［J］.细胞与分子免疫学杂志，2011，27(5):504-508.

［3］朱 靖，杨娜娜，李 浩，等.噬菌体cDNA文库向质粒cDNA文库转化的研究［J］.家畜生态学报，2006，27(1):1-2.

［4］尚 毅，马璐琳，亓增军，等.噬菌体cDNA文库的筛选方法的改良［J］.生物学杂志，2010，27(5):91-93.

［5］Hanke J，Hoheisel J D.Construction and screening of cosmid libraries［M］.The Nucleic Acid Protocol Handbook，2000，405-414.

［6］安 洋，杨 晶，徐欣欣，等.一种用于构建红色红曲霉基因组Cosmid文库的大片段DNA制备方法［J］.微生物学报，2009，49(10):1385-1388.

［7］王雅丽，徐旭东.小球藻南极株和温带株基因组Cosmid文库的构建［J］.水生生物学报，2011，35(6):1063-1066.

［8］Ioannou P A，Amemiya C T，Garnes J，et al.A new bacteriophage P1-derived vector for the propagation of large human DNA fragments［J］.Nature Genet，1994，6:84-89.

［9］Amemiya C T，Amores A，Ota T，et al.Generation of a P1 artificial chromosome library of the Southern pufferfish［J］.Gene，2001，272:283-289.

［10］Han Y F，Mo Z L，Mao Y X，et al.Construction and characterization of a fosmid library for pathogenic bacterium Vibrio anguillarum［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2009，27(3):519-526.

［11］Park T H，Park B S，Kim J A，et al.Construction of random sheared fosmid library from Chinese cabbage and its use for Brasscia rapa genome sequencing project［J］.Journal of Genetics and Genomics，2011，38:47-53.

［12］马 宁，曾地刚，陈晓汉.凡纳滨对虾基因组fosmid文库的构建及钙离子通道基因的筛选［J］.武汉大学学报，2010，56(3):348-352.

［13］樊 帆，张俊青，胡帅星，等.高通量低成本fosmid文库构建的方法及其所使用的标签和标签接头［p］.中华人民共和国，102409043A，2012-04-11.

［14］Kim Y H，Sugiyama M，Yamagishi K.A versatile and general splitting technology for generating targeted YAC subclones［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，69:65-70.

［15］Higashino A，Sakate R，Kameoka Y，et al.Whole-genome sequencing and analysis of the Malaysian cynomolgus macaque(Macaca fascicularis)genome［J］.Genome Bioligy，2012，13:1-11.

［16］Kim J A，Kim J S，Hong J K，et al.Comparative mapping，genomic structure，and expression analysis of eight pseudo-response regulator genes in Brassica rapa［J］.Genet Genomics，2012，287:373-388.

［17］黄 胜，李 娜，周 俊，等.适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用［J］.微生物学报，2012，52(1):30-37.

［18］Deborah O C，Borowski A H，Leung J D.Generation of transgenic mice and germline transmission of a mammalian artificial chromosome introduced into embryos by pronuclear microinjection［J］.Kluwer Academic Publishers，2000，8:183-191.

［19］Bergmann J H，Martins N M C，Larionov V，et al.Hacking the centromere chromatin code:insights from human artificial chromosomes［J］.Springer Science Business Media，2012，20:505-519.

［20］程在全，黄兴奇，张 薇，等.BIBAC基因文库混合池的构建方法及其混合池和基因的快速筛选方法［P］.中华人民共和国，102443854A，2012-05-09.

［21］魏士平，王 扬，刘耀光，等.稻瘟菌TAC文库的构建与评价(英文)［J］.植物病理学报，2003，33(1):57-62.