张乐，周世文，徐颖，应懿，黄永平，汤建林（第三军医大学新桥医院临床药理基地，重庆400037）

坎地沙坦酯是一种血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体AT1亚型拮抗药，在化学结构上与氯沙坦、伊贝沙坦相似，同属二苯四咪唑类。它可选择性地阻滞由AT1受体所介导的AngⅡ功能（如血管收缩和醛固酮分泌），从而发挥降压作用。其与AT1受体的亲和力是AT2受体的10000倍，具有亲和力强和解离慢的特点。临床研究表明，每日给予高血压患者本品4～16 mg，其降压作用呈剂量依赖性，降压效果优于氯沙坦50 mg。坎地沙坦酯口服后迅速从胃肠道吸收，并水解成具有活性的代谢产物坎地沙坦产生血管收缩对抗作用。食物对本品吸收没有影响，重复给药无蓄积作用。由于坎地沙坦酯血浆中药物含量低且内源性物质干扰大，采用常规的高效液相色谱（HPLC）-紫外测方法难以达到所需的检测灵敏度[1]。本试验根据药物的理化性质及国内外文献[1]，设计建立了高效液相色谱-荧光法，用于坎地沙坦的测定，并对坎地沙坦酯制剂进行人体生物等效性研究。

1 材料

1.1 仪器

Waters-600 E型高效液相色谱系统，配2475型荧光检测器，717 plus型自动进样器及Millennium32色谱管理软件（美国Waters公司）；MC-210 S型电子天平（精度0.01 mg，德国Sartorius公司）；高速离心机（美国Abbott公司）；Millipore超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

受试制剂（T）：坎地沙坦酯胶囊（重庆市西曦药物技术开发有限公司生产，每粒含坎地沙坦酯4 mg，批号：061001）；参比制剂（R）：坎地沙坦酯片（商品名：必洛斯，日本武田药品工业株式会社生产，重庆市西曦药物技术开发有限公司提供，每片含坎地沙坦酯8 mg，批号：060601）；坎地沙坦对照品（重庆圣华曦制药有限公司，纯度：99.5%）；内标：缬沙坦对照品（重庆圣华曦制药有限公司，纯度：99.0%）；三乙胺（德国Fluka公司，纯度≥99.5%）；乙醚、甲醇均为色谱纯，磷酸等其他试剂均为分析纯，试验用水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；保护柱：C18柱芯（4.0 mm×3.0 mm）；流动相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（66∶34，V/V，磷酸调pH至4.0）；流速：1 ml/min；激发波长：265 nm，发射波长：395 nm；柱温：30℃。在选定的色谱条件下，分别考察了7个不同来源的空白血浆、空白血浆+对照品及实测样品的色谱分离情况。结果表明，被测物、内标与血浆内源性杂质分离完全，无干扰。坎地沙坦和内标峰的保留时间分别为5.9、8.9 min。测得坎地沙坦色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 坎地沙坦标准溶液：准确称取坎地沙坦对照品5.38 mg于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为107.6 μg/ml的对照品贮备液，于4℃避光保存。临用前，精密吸取该贮备液4 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成43.04µg/ml的坎地沙坦标准溶液，于4℃避光保存，备用。

2.2.2 内标溶液：准确称取缬沙坦对照品5.13 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为51.3 μg/ml的内标贮备液，4℃保存。临用前，取内标贮备液1 ml于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成5.13 μg/ml的内标溶液备用。

2.3 血浆样品预处理

取血浆1 ml加入内标溶液（5.13 μg/ml缬沙坦）50 μl，混合均匀后，加入1 mol/L盐酸200 μl，涡旋混合3 min，加入乙醚5 ml提取，完全旋涡，3000 r/min离心10 min，取乙醚层置于另一试管中，37℃氮气吹干，残留物加入流动相300 μl溶解，旋涡混合1 min，4000 r/min离心20 min，取上清液100 μl进样。

2.4 标准曲线的制备

取空白血浆1 ml依次加入内标溶液（5.13 μg/ml缬沙坦）50 μl和不同浓度系列标准溶液50 μl，配制成相当于坎地沙坦血浆质量浓度为 0.98、1.95、3.91、7.81、15.62、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml的血浆标准样品。按“2.3”项下依法操作，每一浓度进样100 μl，记录色谱图，以质量浓度（x）为横坐标，药物与内标峰面积之比（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程y＝－6.32×10－3x+1.03×10－2（r＝0.9997）。说明坎地沙坦血药浓度在0.98～500.00 ng/ml范围内线性关系良好。血浆中坎地沙坦定量下限为0.98 ng/m（l信噪比为5，x ＝1.11 ng/ml，RSD＝11.5%，n＝5）。

2.5 精密度试验

取空白血浆1 ml，按“2.4”项下方法配制低、中、高3个质量浓度的血浆样品各5份，按“2.3”项下依法操作，于同一天不同时间段测定，考察日内精密度。3个质量浓度的血浆样品各5份，连续测定3 d，考察日间精密度，结果见表1。

2.6 回收率试验

表1 精密度及回收率试验结果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.6.1 相对回收率：取空白血浆1 ml，按“2.4”项下的方法制备低、中、高3个质量浓度（坎地沙坦血浆浓度分别为1.95、31.25、250 ng/ml）的样品各5份并依法测定。将药物与内标峰面积之比代入标准曲线求得药物浓度，其与实际药物浓度的比值即为相对回收率，结果见表1。

2.6.2 绝对回收率：取空白血浆1 ml，按“2.4”项下的方法制备低、中、高3个质量浓度（坎地沙坦血浆浓度分别为1.95、31.25、250 ng/ml）的样品各5份并依法测定。以提取后待测物色谱峰面积与相同浓度未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比，计算样品的绝对回收率，结果见表1。

2.7 稳定性试验

本试验考察了未经处理的坎地沙坦血浆样品室温放置24 h，－20℃冷冻放置21 d及冻融3次的稳定性，结果见表2。

表2 稳定性试验结果Tab 2 Results of stability test

2.8 血样采集

根据国家药品监督管理局新药临床研究批件（2003 L00047），经院伦理委员会批准，20名健康男性受试者在知情情况下填写知情同意书，并实施试验。20名健康受试者口服8 mg受试制剂或参比制剂后，分别采集服药前及服药后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h时的静脉血约4 ml肝素抗凝，分离得到血浆于，－20℃冰箱保存，待测血药浓度。

2.9 药动学参数

用BECS软件程序对经对数换后的AUC0-t、AUC0-∞、cmax和实测tmax进行统计分析。方差分析后进行双单侧t检验及90%的可信限判断，坎地沙坦酯胶囊经对数转换后AUC0-t、AUC0-∞的90%可信限分别落在参比制剂的80.4%～107.3%和80.2%～107.0%范围内。经对数转换后cmax的90%可信限落在参比制剂的80.1%～111.6%范围内。tmax经非参数检验无显著性差异。由此判断2种制剂生物等效。20名受试者单剂量口服8 mg受试制剂或参比制剂后的平均药-时曲线见图2。

图2 20名健康受试者分别口服受试制剂和参比制剂后坎地沙坦药-时曲线Fig 2 Mean plasma concentration-time curves in 20healthy volunteers of test and reference candesartan preparations

3 讨论

在摸索流动相体系的过程中，我们考察了流动相中甲醇的不同体积分数（70%、66%、60%）及流动相的不同pH值（5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5）对分析结果的影响，通过比较，选择本流动相效果最佳。在此条件下，杂质峰对样品峰干扰小，保留时间适宜，坎地沙坦和内标缬沙坦保留时间分别为5.9 min和8.9 min，与文献报道相比均有所提前，既节省进样时间又节省试验经费。样品处理时考虑到操作的方便性，采用盐酸沉淀蛋白后直接用乙醚提取，坎地沙坦提取回收率较高，且不受内源性物质的干扰，同时还提高了测定灵敏度，定量下限为0.98ng/ml。试验结果表明，本法可用于该药的血浆含量测定及制剂的生物等效性研究。

[1]Stenhoff H，Per-Olof lagerström，Andersen C.Determination of candesartan cilexetil，candesartan and a metabolite in human plasma and urine by liquid chromatography and fluorometric detection[J].Journal of Chromatography B，1999，731（9）：411.