刘清霞， 叶开和， 王婧茹， 叶春玲△， 黄 仪， 张晓琦， 叶文才

(暨南大学药学院1药理学教研室，2中药及天然药物研究所，中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东广州510632)

番石榴(Psidium guajava L．)为桃金娘科番石榴属植物，广泛分布于我国华南地区。上世纪80年代，我国在进行植物药普查中发现，民间使用番石榴叶防治糖尿病和肥胖症有效果，以番石榴叶粗提取物为原料的制剂“消渴降糖胶囊”的临床疗效显著，但其降血糖的活性成分和作用机制尚不清楚。本课题组首次发现番石榴叶总三萜(total triterpenoids)是番石榴叶中抗糖尿病作用的主要有效部位，并能显著降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，改善胰岛素抵抗［1］。积雪草酸(asiatic acid)为五环三萜类化合物，是番石榴总三萜的主要成分，已有研究发现其具有抗氧化，抗炎、肝脏保护和抗糖尿病作用［2-3］。为了深入探讨积雪草酸的抗糖尿病作用及其机制，本研究采用3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型，观察积雪草酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化以及胰岛素抵抗脂肪细胞糖脂代谢的影响并探讨其抗糖尿病作用机制。

材料和方法

1 材料

1．1 细胞 3T3-L1前脂肪细胞购自中国科学院上海细胞库。于含10%胎牛血清高糖DMEM培养液中(含1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，置于37℃、湿度95%、5%CO2细胞培养箱内传代培养，实验均采用对数生长期细胞。

1．2 药物与试剂 积雪草酸来源于番石榴的干燥叶，溶剂法纯化工艺提取，纯度为98%，实验前用DMSO溶解，4℃保存。马来酸罗格列酮(rosiglitazone maleate，Ros)购自上海源叶生物科技有限公司;正钒酸钠(sodium orthovanadate，Van)购自阿拉丁公司;高糖DMEM购自Gibco;胎牛血清购自浙江天杭生物科技公司;油红O购自Sigma;葡萄糖检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司;游离脂肪酸测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。

1．3 仪器 NU-4750型二氧化碳培养箱(NuAire);TD80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂);LAC-110．4型电子天平(Acculab);Model 680酶标仪(Bio-Rad);WO-9413B型凝胶成像系统(北京六一仪器厂)。

2 方法

2．1 3T3-L1前脂肪细胞的体外培养及诱导分化 将3T3-L1前脂肪细胞接种于细胞培养板，用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、湿度95%、5%CO2环境中培养。待细胞融合后，加含有0．5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰岛素的高糖DMEM培养基诱导48 h后，换为含10 mg/L胰岛素的高糖DMEM培养基再培养48 h，随后换用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，每隔2 d换液，诱导分化8～12 d后，90%以上呈脂肪细胞表型可用于实验。

2．2 MTT法测定3T3-L1前脂肪细胞增殖 将3T3-L1前脂肪细胞转入96孔板中，调整细胞密度为5×103cells/well。设置空白对照组(control)、溶媒对照组(medium)、积雪草酸处理组、罗格列酮(10 μmol/L)对照组和正钒酸钠(10μmol/L)对照组。空白对照组给予正常DMEM，溶媒对照组给予含0．1%DMSO的DMEM，积雪草酸处理组分为3、10、30和100 μmol/L。3T3-L1前脂肪细胞按照不同处理方法作用48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20μL，在37℃培养箱中孵育4 h后，吸出旧培养液，每孔加入150μL DMSO，混匀后置酶标仪主波长为570 nm，副波长为630 nm处测量吸光度值，观察积雪草酸对3T3-Ll前脂肪细胞增殖的影响。增殖率(%)=(实验组吸光度值－空白对照组吸光度值)/空白对照组吸光度值×100%。

2．3 油红O染色鉴定3T3-L1前脂肪细胞分化 将3T3-L1前脂肪细胞转入96孔板中，调整细胞密度为5×103cells/well，进行诱导分化实验。在诱导分化第6 d加入不同浓度的药物干预，药物分组同2．2项，作用48 h后弃去培养液，用PBS洗3次，用10%多聚甲醛固定30 min，弃去固定液，用灭菌水洗3次，加入油红O溶液染色30 min后弃之，用灭菌水洗3次，显微镜下观察，然后用异丙醇充分溶解染色脂肪细胞内的油红O，选择520 nm波长在酶标仪上测定吸光度值，观察积雪草酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。分化率(%)=(实验组吸光度值－空白对照组吸光度值)/空白对照组吸光度值×100%。

2．4 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的建立调整上述诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞的细胞密度，转入96孔板中，将其分为对照组和模型组(model)，对照组给予普通高糖DMEM培养基，模型组给予含有1μmol/L地塞米松的培养基，孵育96 h后取细胞上清液，用葡萄糖氧化酶法测定细胞上清液中葡萄糖的含量，用以反映胰岛素抵抗的程度。葡萄糖消耗率(%)=(对照组葡萄糖含量－模型组葡萄糖含量)/对照组葡萄糖含量×100%。

2．5 药物对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的糖脂代谢的影响 将分化成熟3T3-L1脂肪细胞转入96孔板中，调整细胞密度为5×103cells/well，建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型。确定造模成功后分为空白对照组、溶媒对照组、积雪草酸(3、10、30和100μmol/L)处理组、罗格列酮(10μmol/L)对照组和正钒酸钠(10μmol/L)对照组。空白对照组给予正常DMEM，溶媒对照组给予含0．1%DMSO的DMEM。上述各组再分为不加胰岛素处理和加胰岛素处理(20 nmol/L)。药物作用48 h后，分别用葡萄糖氧化酶法检测细胞上清液中葡萄糖含量、比色法检测游离脂肪酸(free fat acid，FFA)的浓度。FFA抑制率(%)=(空白对照组FFA含量－实验组FFA含量)/空白对照组FFA含量×100%。

2．6 ELISA法测定脂联素分泌 将建模成功的胰岛素抵抗脂肪细胞分为溶媒对照组(给予含0．1%DMSO的DMEM)、积雪草酸(10、30和100μmol/L)处理组、罗格列酮对照组和正钒酸钠对照组。此外，取分化成熟的正常脂肪细胞另设为正常对照组(control)，其不做任何处理。其它各组药物作用48 h后，按试剂盒ELISA法检测脂联素含量。

2．7 Western blotting法测定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)蛋白表达 收集药物处理后的细胞，弃去培养液，用冰PBS清洗3次，加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解10 min，将细胞刮下收集到EP管中。12 000×g、4℃离心10 min，取上清，通过Bio-Rad蛋白实验进行总蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，然后湿转法(200 mA、1．5 h)将蛋白转移到硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后。加Ⅰ抗孵育4℃过夜，PBST清洗3次后加Ⅱ抗，37℃孵育1 h，PBST洗3次后，加入ECL化学发光试剂增强反应，X线压片曝光，采用WO-9413B型凝胶成像系统自带软件Gelpro32来分析胶片中的蛋白条带。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS19．0软件进行统计分析，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 积雪草酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响

与溶媒对照组相比，积雪草酸在浓度10～100 μmol/L时能显著促进3T3-L1前脂肪细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，在浓度100μmol/L时其增殖提高率达24．1%;同时，明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化(P＜0.05或P＜0.01)。阳性对照药罗格列酮和正钒酸钠的结果则表现为在显著促进3T3-L1前脂肪细胞增殖的同时促进其分化(P＜0.01)，见表1。

表1 积雪草酸对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响Table 1．Effects of asiatic acid on the proliferation and differentiation in 3T3-L1 preadipocytes(Mean±SD．n=6)

2 胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立

在地塞米松作用下，脂肪细胞对培养基中葡萄糖的摄取减少，导致模型组的葡萄糖消耗率比溶媒对照组明显减少(减少44．2%，P＜0.01)，说明胰岛素抵抗的脂肪细胞模型建立成功，见图1。

Figure 1．The changes of glucose uptake in insulin-resistant adipocytes．Mean ± SD．n=6．＊＊ P ＜ 0.01 vs medium group．图1 胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖摄取情况

3 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗和游离脂肪酸产生的影响

与溶媒对照组相比，无论在基础状态还是胰岛素刺激状态，积雪草酸在浓度30μmol/L和100 μmol/L时均显著促进胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗(P＜0.05);同时，其显著减少胰岛素抵抗细胞游离脂肪酸的产生，与溶媒组比较差异显著(P＜0.05)。阳性对照药罗格列酮和正钒酸钠的结果与积雪草酸相似，均显著促进胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗，减少游离脂肪酸的产生(P＜0.01)，见表2。

表2 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗和游离脂肪酸产生的影响Table 2．Effects of asiatic acid on glucose uptake and FFA production in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

4 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞脂联素分泌的影响

脂肪细胞发生胰岛素抵抗后，其脂联素分泌较正常对照组显著减少(P＜0.01);与溶媒对照组相比，罗格列酮能显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞的脂联素分泌(P＜0.01);而积雪草酸和正钒酸钠对胰岛素抵抗脂肪细胞脂联素分泌则无明显升高作用(P＞0.05)，见表3。

表3 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞脂联素分泌的影响Table 3．Effects of asiatic acid on adiponectin secretion in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

5 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞的PPARγ和PTP1B蛋白表达的影响

药物作用48 h后，与溶媒对照组相比，积雪草酸和正钒酸钠对PPARγ蛋白表达无明显影响(P＞0.05)，但能显著下调胰岛素抵抗脂肪细胞PTP1B蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。罗格列酮则相反，其能显著上调胰岛素抵抗脂肪细胞PPARγ蛋白表达(P＜0.01)，但对PTP1B蛋白表达则无明显影响(P ＞0.05)，见图2、3和表4。

Figure 2．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～ 4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Ros(10μmol/L)group;6:Van(10 μmol/L)group．图2 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞的PPARγ蛋白表达的影响

Figure 3．Effects of asiatic acid on the expression of PTP1B in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Van(10μmol/L)group;6:Ros(10 μmol/L)group．图3 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞的PTP1B蛋白表达的影响

表4 积雪草酸对胰岛素抵抗脂肪细胞的PPARγ和PTP1B蛋白表达的影响Table 4．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ and PTP1B in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

讨 论

胰岛素抵抗是2型糖尿病重要的发病机制之一，贯穿2型糖尿病的发生、发展全过程［4］。脂肪组织是胰岛素作用的主要靶组织，其糖脂代谢异常在胰岛素抵抗的发生发展中起重要作用［5］。正常情况下白色脂肪组织以脂肪的形式储存过量能量，一旦能量摄取持续超过能量消耗时，脂肪组织不仅体积扩增肥大，而且脂肪细胞数量增多。肥大的脂肪细胞会分泌多种脂肪因子，如肿瘤坏死因子α、瘦素、抵抗素、脂联素等以直接干预胰岛素信号转导。而过度分泌的FFA及某些脂肪因子可以进一步影响其它组织对胰岛素的敏感性，也对胰岛β细胞产生毒性，影响其胰岛素的合成和分泌，加重糖脂代谢的紊乱。

3T3-L1前脂肪细胞系在胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的刺激下，具有分化为成熟脂肪细胞的能力，是目前国际上研究胰岛素抵抗、肥胖及体外脂肪细胞分化的常用工具［6］。为此，本实验选用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，发现积雪草酸显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗和减少游离脂肪酸的产生，表明积雪草酸对胰岛素抵抗具有明显的改善作用。

PPARγ是一种在脂肪组织发育和功能中起重要作用的转录因子。激活PPARγ能促进前脂肪细胞增殖和分化，增加对胰岛素敏感的小脂肪细胞的数量，减少游离脂肪酸的产生，提高脂肪细胞胰岛素敏感性，并最终改善胰岛素抵抗。以PPARγ为靶点的噻唑烷二酮类药物(如罗格列酮)早已作为胰岛素增敏剂被广泛应用。脂联素作为近年发现的脂肪细胞因子之一受到广泛关注，具有改善糖脂代谢、增加机体胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗等作用［7］。本实验发现，积雪草酸促进前脂肪细胞增殖，增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖利用，降低游离脂肪酸产生，该结果与罗格列酮相似。但是，对前脂肪细胞分化的影响则相反，罗格列酮表现为促进，而积雪草酸则表现为抑制作用。此外，罗格列酮能明显增加胰岛素抵抗脂肪细胞的脂联素水平，但积雪草酸和正钒酸钠则未有此作用。由此我们分析推测，积雪草酸改善胰岛素抵抗的作用机制可能不同于罗格列酮。

胰岛素抵抗可以发生在胰岛素信号转导过程中的多个环节。蛋白酪氨酸磷酸酶在胰岛素作用的信号转导途径中起到重要的负调节作用，其中PTP1B的作用尤其显著。PTP1B主要分布于细胞浆内，胰岛素与受体结合后，促使胰岛素受体β亚单位和胰岛素受体底物1的磷酸酪氨酸残基去磷酸化，负性调节胰岛素信号转导下调［8-9］。越来越多的证据表明:PTP1B通过去磷酸化作用影响了胰岛素信号转导，对胰岛素抵抗和肥胖的发生起重要作用［10-11］。PTP1B抑制剂可抑制胰岛素受体的去磷酸化，从而延长和扩大胰岛素关键性早期信号的转导。因此，寻找高效特异性的PTP1B抑制剂为治疗2型糖尿病和肥胖开辟了新的途径。正钒酸钠是公认的PTP1B抑制剂，故本实验选择它作为阳性对照药之一，结果发现积雪草酸与正钒酸钠作用相似，在提高胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖利用、减少游离脂肪酸产生的同时，对胰岛素抵抗脂肪细胞的脂联素分泌以及PPARγ蛋白表达无明显影响，但可下调PTP1B蛋白表达。因此，我们推测，下调胰岛素信号转导的负性调节因子PTP1B，促进胰岛素信号转导，可能是积雪草酸改善胰岛素抵抗的主要机制。