袁 青 黄 黎 郭夕源 叶迎春 年四季

(泸州医学院基础医学院，泸州646000)

白细胞介素(IL)IL-4和IL-13表达于2型辅助性T细胞(Th2)和肥大细胞上，是遗传性过敏症和过敏性炎症疾病如哮喘发病机制中关键的细胞因子［1，2］。IL-4和 IL-13都可促进急性炎性过程和呼吸道基本结构的变化，促进其受体在多种类型的细胞上表达［3］。遗传性过敏症和过敏性炎症疾病的一个共同关键特征是活化的B淋巴细胞上免疫球蛋白M向免疫球蛋白E种型转换，而免疫球蛋白M向E转换在很大程度上是受IL-4/IL-13细胞因子途径激活的影响［4］。IL-4和IL-13信号通过一共同的途径:在T细胞表面，通过由IL-4受体 α链(IL-4Rα)和共同g链之一(用于结合IL-4和IL-13)或IL-13受体α链(IL-13Rα)(专一用于IL-13结合)组成的异质二聚体促进IL-4和IL-13的结合。细胞内信号通过酪氨酸激酶介导的信号传导器和转录激活子(STAT6)的磷酸化所启动，一旦磷酸化，STAT6分子形成二聚体，进入细胞核，激活靶基因转录，诱导产生IgE［5-7］。此外，IL-4和IL-13还参与多种免疫调节和促炎活化，对过敏性炎症及哮喘起着诱导、增强及控制的作用。

基于IL-4和IL-13信号途径在过敏性炎症疾病中所发挥的重要作用，制备中和性抗IL-4和IL-13双特异性抗体，从而封阻它们的生物学活性，对于过敏性炎性疾病的控制具有很大的潜力。本研究从前期构建的天然人源抗体文库中分别筛选抗IL-4和IL-13单链抗体，以用于后期IL-4/IL-13双特异性抗体的构建。

1 材料与方法

1.1 材料 人外周血取自健康志愿者;mRNA提取试剂盒购自Invitrogen公司;pET的directional TOPO expression kits购自 Invitrogen公司;Oligo dT15和MMLV反转录酶购自Promega公司;Ni-NTA亲和纯化系统购自Invitrogen公司;DNA标准分子量为New England Biolabs公司的100 bp DNA ladder;蛋白Marker为TaKaRa公司的低分子量蛋白Marker;蛋白预染Marker为Invitrogen公司的BenchMarkTMpre-stained protein ladder。大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07及pCANTAB-5E噬菌体载体均购自Gene公司。

1.2 方法

1.2.1 IL-4和IL-13基因扩增 从健康志愿者外周血中分离单核细胞，采用mRNA提取试剂盒提取mRNA(Invitrogen，USA)。以mRNA为模板，用Oligo dT15、MMLV 反转录酶(promega，USA)反转录合成cDNA。从NCBI中下载人IL-4和IL-13基因序列，设计引物。用于扩增IL-4的上游引物IL-4F:5'-CACCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGC-3';下游引物 IL-4R:5'-GGAATTCAAGCCCGCCAGGCC-3'。用于扩增IL-13的上游引物IL-13F:5'-CACCTGCCTTGGCGGCTTTGCCTCC-3';下游引物 IL-13R:5'-AGCTGAGACCTTGTGCGGGCA-3'。上游引物 5'端添加了4个碱基CACC用于PCR产物直接连接到pET102/D-TOPO载体上。取合成的 cDNA 2 μl作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序为94℃ 2分钟，然后94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，35次循环，最后72℃延伸10分钟。

1.2.2 IL-4、IL-13的表达纯化 取 IL-4、IL-13 PCR产物按照pET Directional TOPO expression kit(Invitrogen，USA)说明书进行连接和转化入E.coli One Shot-TOPO，提取阳性质粒，测序验证转化的DNA序列正确后，将含正确插入序列的pET102/IL-4、pET102/IL-13阳性重组质粒转化 E.coli BL21，过夜培养后取2 ml接种到含50 μg/ml羧苄青霉素的100 ml LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养至A600=0.5左右，加入终浓度为1 mmol/L IPTG于30℃培养5小时后，8 000 r/min离心培养液10分钟，收集沉淀保存用于SDS-PAGE鉴定和后续纯化。

按照购自Invitrogen公司的Ni-NTA亲和纯化系统中Hybrid(杂交法)纯化得到有生物学活性的IL-4和IL-13蛋白，并进行 Western blot鉴定。由于pET102/D-TOPO载体带有6×His-tag，表达纯化的蛋白采用抗组氨酸单克隆抗体(GE Healthcare，来源于小鼠)和马抗小鼠IgG抗体(Promega，USA)进行鉴定，最后加入底物NBT/BCIP进行显色。

1.2.3 抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选 前期工作已构建了天然人源性scFv抗体文库，文库容量达到了 2.5 ×108，多样性良好［8］。纯化的 IL-4 或IL-33蛋白根据EZ-Link®Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒(Thermo Scientific)进行生物素化。约5×1011TU新鲜制备的scFv抗体文库噬菌体用封闭液(1×PBS缓冲液中含3%BSA，0.05%Tween 20)于室温封闭1小时，加入10 μg生物素化蛋白于封闭后的scFv抗体文库噬菌体中，于37℃缓慢振荡孵育1小时;按说明书加入链霉亲和素包被的M-280磁珠(streptavidin-coated Dynabeads M-280，Invitrogen)于混合液中，缓慢室温振荡30分钟捕获IL-4(IL-13)蛋白-抗IL-4(IL-13)特异性噬菌体复合体。用PBS/Tween 20洗涤磁珠5～10次，然后用0.1 mol/L HCl(pH2.2)使特异性噬菌体解离，感染大肠杆菌TG1后涂2×YTAG(2×YT平板含100 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖)，从平板上洗下所有菌落用于噬菌体文库扩增。生物素化的1 μg IL-4或100 ng IL-13用于第2轮和3轮亲和筛选。

1.2.4 噬菌体扩增 取40 μl从平板上洗下的抗体文库菌悬液加入到40 ml 2×YTAG(2×YT平板含100 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖)培养基中，于37℃培养至A600=0.2。离心沉淀细菌，用40 ml 2×YTA(2×YT平板含100 μg/ml氨苄青霉素)重悬细菌，加入约6×109TU辅助噬菌体 M13K07，37℃静止感染15分钟，然后200 r/min 37℃ 振荡培养2小时。加入终浓度20 μg/ml卡拉霉素后于32℃振荡培养过夜。次日用PEG/NaCl溶液(20%PEG，2.5 mol/L NaCl)沉淀噬菌体，用1×PBS重悬噬菌体。

1.2.5 噬菌体 ELISA 包被液(50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3，pH9.6)稀释的 10 μg/ml IL-4 或 IL-13纯化蛋白于酶标板内4℃包被过夜。次日封闭液(1×PBS含5% 脱脂奶粉和0.05%Tween-20)37℃封闭酶标孔1小时，洗涤酶标板。加入等倍体积封闭夜室温封闭30分钟的噬菌体溶液，37℃孵育1小时。洗涤酶标板后，加入HRP标记抗M13单克隆抗体(Amersham Biosciences)37℃孵育1小时，最后用TMB显色液显色，于450 nm处读取吸光值(A)。

2 结果

2.1 IL-4、IL-13的扩增 从外周血单核细胞mR-NA中成功扩增得到IL-4和IL-13 cDNA片段。IL-4扩增片段为 280 bp，IL-13扩增片段为 252 bp，见图1。经序列测定及NCBI BLAST比对，所扩增的IL-4和IL-13序列正确。

2.2 IL-4、IL-13的纯化及鉴定 pET102/D-TOPO融合表达载体携带有氨苄青霉素抗性基因，对于大多数蛋白采用氨苄青霉素作为抗性筛选可对蛋白进行很好的表达。但如果表达量比较低，那么则可以选择羧苄青霉素。pET102/D-TOPO融合表达载体N端携带硫氧还蛋白标签，C端V5，6×His标签，有利于增加表达蛋白的可溶性，并有利于目的蛋白的鉴定。表达后，对表达产物进行了SDS-PAGE分析，表达的IL-4目的融合蛋白大小为27 kD，IL-13目的融合蛋白为25 kD左右(包括了两端连接的标签，图2)。表达产物一部分为没有生物学活性的包涵体，也有一部分蛋白为可溶性蛋白。经用Ni-NTA亲和纯化系统纯化得到有生物学活性的可溶性蛋白并进行Western blot鉴定，证明表达纯化的蛋白即为目的蛋白IL-4和IL-13(图2)。

2.3 抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选 对天然人源scFv抗体文库分别用IL-4或IL-13生物素化蛋白作为抗原采用免疫磁珠法进行了3轮噬菌体展示筛选后，分别从3轮富集后的抗体文库中随机挑取克隆子，进行单个克隆子噬菌体扩增，采用噬菌体ELISA对表达的单个scFv以抗HRP标记的M13单克隆抗体进行检测，结果显示:经过3轮富集后，特异性单链抗体得到富集，分别有37%左右的 scFv对IL-4显示阳性，27%左右的scFvs对IL-13显示阳性(图3)。

2.4 单链抗体的鉴定 挑取分别与IL-4或IL-13结合能力强的4株单链抗体，进行了表达、纯化和Western blot鉴定，结果显示表达产物在约32 kD处有靶带，为表达的单链抗体(图4)。说明从天然的人源抗体文库中成功地筛选到了抗IL-4和抗IL-13单链抗体，但一般从天然抗体文库中筛选到的单链抗体其亲和力相对较低，后期我们将根据筛选到的抗IL-4或IL-13单链抗体构建突变文库，以筛选到高亲和力单链抗体。

图1 RT-PCR扩增IL-4和IL-13 cDNAFig.1 Amplifaction of the cDNA of IL-4 or IL-13 by RT-PCR

图2 SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的IL-4、IL-13蛋白Fig.2 Purification and identification of IL-4 and IL-13 by Western blot

图3 ELISA筛选抗IL-4、IL-13单链抗体Fig.3 Selection of scFvs against IL-4 or IL-13 by ELISA

图4 SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的抗IL-4、IL-13单链抗体Fig.4 Identification of purified scFvs against IL-4 or IL-13 by SDS-PAGE and Western blot

3 讨论

IL-4和IL-13由Th2和肥大细胞产生，通过激活嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞促进气道炎症，增强纤维母细胞的增殖/活化引起气道重塑;激活B细胞产生IgE;刺激气道上皮细胞/杯状细胞产生黏液;激活气道平滑肌细胞引起气道高反应性［9］，在过敏性炎症疾病如哮喘中起着重要的作用。靶作用于IL-4和IL-13的生物复合物可为严重过敏性炎症病人提供新的治疗手段。小鼠哮喘模型中，单独敲除或封阻IL-4能抑制过敏性炎症应答和其他哮喘症状［10］。研究发现一种包含人源IL-4R-α链胞外蛋白的可溶性IL-4受体片段(Altrakincept)，能竞争性地抑制IL-4与受体结合，在早期研究中对人轻度和中度哮喘有一定的效果，但对顽固性哮喘作用不明显［11］。而又有一些研究者发现用抗IL-13单克隆抗体或可溶性受体可减少肺部炎症、降低气道反应性、减少黏液分泌［12］。但单独阻断 IL-4或IL-13一种细胞因子的生物学活性，其治疗效果并不特别理想。通过深入研究哮喘等过敏性炎症疾病的致病机理，IL-4/IL-13信号途径在其致病机制中发挥着关键的作用，若同时封阻IL-4和IL-13生物学活性，将会取得更好的治疗效果。

本研究中使用的抗体文库为人源天然抗体文库，从天然抗体文库中筛选的单链抗体一般亲和力较低，所以后期本研究小组将针对筛选的抗IL-4和IL-13单链抗体分别构建突变文库，从而筛选到高亲和特异性的抗IL-4和IL-13单链抗体，为抗IL-4和IL-13双特异性的构建打下基础。

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