朱翠明 陈苏芳 余敏君 游晓星 唐双阳 吴移谋

(南华大学病原生物学研究所，衡阳421001)

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是儿童社区获得性肺炎的主要病原体，一年四季都可发病，但大多数发生于夏末秋初，以5～15岁的青少年发病率最高，占儿童肺炎的10% ～30%，流行期间可达30% ～50%［1，2］。Mp 感染多用大环内酯类药物治疗，但近年来耐药菌株不断增多，给临床治疗带来困难［3，4］。因此研制有效的疫苗预防Mp感染十分必要。

对Mp疫苗灭活疫苗、减毒活疫苗和菌体成分疫苗的研究效果均不理想［5］。核酸疫苗在体内表达的抗原具有天然的空间构象，能有效刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，是近年来研究热点。在以往的研究中，我们发现P1蛋白羧基端的第1 125～1 395位氨基酸(P1C蛋白)具有较强的免疫原性，其所诱生的抗体能阻止Mp对细胞的粘附，是研究Mp疫苗的理想候选分子［6］。并构建了P1C核酸疫苗，发现其能诱导小鼠产生一定的免疫应答水平和免疫保护作用［7，8］。

白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是一种最常用的细胞因子免疫佐剂，能显著增强疫苗的免疫效果［9］，我们实验室也发现IL-2对梅毒螺旋体、人乳头瘤病毒和幽门螺杆菌核酸疫苗有良好的佐剂效应［10-12］。本研究将p1c基因和IL-2基因联合构建在同一真核细胞表达载体上，肌注免疫 BALB/c小鼠，检测其所诱发的免疫应答水平和免疫保护作用，了解IL-2对P1C核酸疫苗的免疫佐剂效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂 Mp M129株(ATCC 29342)、pcDNA3.1(+)(缩写为 pcD)、pcDNA3.1(+)/IL-2(缩写为 pIL-2)、pcDNA3.1(+)/P1C(缩写为pP1C)由南华大学病原生物学研究所保存;SP4液体和固体培养基为Oxoid产品;去内毒素质粒大量抽提试剂盒购自Qiagen;HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)购自Santa Cruz;小鼠IFN-γ和IL-4定量检测试剂盒购自R＆D Systems。

1.1.2 实验动物 BALB/c鼠由武汉大学实验动物中心提供，南华大学实验动物中心饲养。

1.2 方法

1.2.1 Mp的培养 将Mp M129菌株转种至20 ml SP4培养基中，37℃培养5～7天至培养基颜色由红变黄后弃上清，加入2 ml SP4培养基，收获烧瓶底部的Mp，其浓度约108～109菌落形成单位［(Colony-Forming unit，CFU)/ml，CFU/ml］。

1.2.2 核酸疫苗的构建 以本研究所保存的pP1C为模板，设计引物，并在其下游引物中引入一个Linker基因:GATCCCCGGGTACCGAGC(编码Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Ser)，用上游引物 p1c-F 5'-GGGGATCCATGACGGACTTTGTCAAACC-3'和下游引物 p1c-Linker-R 5'-GATCCCCGGGTACCGAGCCCCATCTAACAGTTCAGC-3'扩增得到 p1c-Linker基因;以 pIL-2质粒为模板，用上游引物Linker-IL-2-F 5'-GCTCGGTACCCGGGGATCTACAGGATGCAACTCC-3'和下游引物IL-2-R 5'-GGAATTCCTAGTTTTCCATACTGAT-3'扩增Linker-IL-2基因;然后以扩增得到的p1c-Linker基因和Linker-IL-2基因为模板，p1c-F和IL-2-R为引物扩增p1c-IL-2基因。将纯化的p1c-IL-2基因和pcD质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4连接酶连接后转化E.coli XL-1 Blue感受态细胞，涂布于含50 μg/ml氨苄西林的LB平板，37℃过夜培养筛选阳性克隆。并通过PCR、酶切、测序鉴定。用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，无菌PBS稀释至 2 μg/μl备用。

1.2.3 免疫接种 将125只4～6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为5组，每组免疫25只小鼠;在各组小鼠左后腿股四头肌分别注射50 μl PBS、pcD、pIL-2、pP1C或pP1C-IL-2。分别于第0、14和28天进行3次免疫。

1.2.4 抗感染实验 小鼠初次免疫后第56天，用乙醚麻醉小鼠，诱导过度通气，在每只小鼠处于吸气相时向其鼻孔内滴入50 μl含有2×107CFU的Mp菌液，正常对照组以等量的SP4培养基滴鼻接种。

1.2.5 样本的收集 在小鼠初次免疫后第56天和Mp 攻击后第1、3、6、9、12 天，分别摘取眼球放血处死小鼠，将收集的血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)冻存于－80℃备用。肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片后用苏木苏和伊红(H＆E)染色，进行肺组织炎症病理评分(Histopathologic score，HPS)。

1.2.6 ELISA 融合重组蛋白rP1C的制备见文献［6］。将1 μg纯化的rP1C 4℃包被酶标板过夜，次日用含0.05%Tween 20的 PBS洗3次后用0.3%的BSA 4℃封闭过夜。将100 μl 1∶50稀释的小鼠血清或1∶4稀释的BALF加入酶标板，37℃孵育1小时后用PBST洗涤4次，再加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a或 IgA，37℃孵育30分钟后用PBST洗涤4次，在各反应孔中加入显色剂 TMB与 H2O2各50 μl，37℃避光孵育10分钟，最后每孔加入50 μl 2 mol/L硫酸终止反应。酶标仪读取OD450值。根据试剂盒说明书，检测小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4的含量，两种细胞因子试剂盒的最低检测量为4 pg/ml。

1.2.7 Mp菌落计数 将25 μl系列倍比稀释的BALF接种至SP4固体培养基，37℃ 95%N2和5%CO2气体条件下，培养5～7天，低倍镜下计数Mp菌落数，用log10CFU/ml表示，本实验最低菌落检出率数为40 CFU/ml。

1.2.8 肺组织病理评分 Mp感染各组小鼠后，用双盲法请组织病理学者根据文献［13］用肺组织病理学评分系统对各组BALB/c鼠肺组织进行炎症评分。

1.3 统计学分析 运用SPSS16.0软件，实验数据以±s表示，均数之间的比较采用单因素ANOVA分析。P＜0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 真核重组质粒鉴定 pP1C-IL-2重组质粒双酶切后用琼脂糖凝胶电泳可见约5.4 kb和1 300 bp的两个条带，其大小与线性化的pCD质粒和p1c-IL-2基因片段相符。以pP1C-IL-2为模板，p1c-F和IL-2-R为引物扩增的得到一约1 300 bp的基因片段，与预期结果一致(图1)。测序鉴定表明获得阳性重组体。

2.2 P1C特异性抗体和抗体亚类 P1C-IL-2和P1C核酸疫苗免疫后56天所产生血清总IgG、IgG1和IgG2a亚类均较PBS、pcD和pIL-2对照组显著增高(P＜0.001)，P1C-IL-2融合疫苗组血清中 IgG、IgG1和IgG2a与P1C单基因疫苗相比，差异有显著性(P＜0.05)，且IgG2a较IgG1的增高更显著。各免疫组BALF中SIgA抗体水平差异无显著性(P＞0.05，图2)。

2.3 IFN-γ和IL-4水平 P1C-IL-2疫苗组和 P1C疫苗组小鼠支气管灌洗液中IFN-γ和IL-4水平均较对照组显著增高，且P1C-IL-2疫苗组小鼠IFN-γ和IL-4水平与P1C免疫组小鼠差异有显著性(P＜0.001 和 P ＜0.05，图3)。

图1 pP1C-IL-2重组质粒的酶切和PCR鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pP1C-IL-2 by endonuclease digestion and PCR

2.4 肺组织病理改变和评分 Mp感染后第1、3、6天，与P1C疫苗组小鼠相比，P1C-IL-2核酸疫苗组小鼠的肺间质炎症病变区域较扩散，淋巴细胞、浆细胞浸润增多，HPS明显增高(P＜0.05)，而与 PBS、pCD、pIL-2对照组差异无显著性(P ＞0.05，图4)。第9、12天P1C-IL-2核酸疫苗免疫组小鼠的HPS与P1C疫苗免疫组差异无显著性(P＞0.05)，且两组HPS均低于对照组(P＜0.05，图4)。用SP4培养基做对照攻击的小鼠HPS为0～1分。

2.5 Mp攻击后各免疫组小鼠Mp菌落计数 用Mp 经呼吸道感染免疫小鼠，1、3、6、9、12 天后 P1CIL-2和P1C疫苗组小鼠BALF中Mp菌落数均低于对照组(P＜0.05)。与P1C核酸疫苗组比较，P1C-IL-2融合基因疫苗组小鼠第1、3、6天 BALF中Mp菌落数明显减少(P＜0.05)，但第9、12天两组 Mp菌落数差异无显著性(图5)。

图2 血清IgG及亚类和支气管灌洗液IgA检测(n=5)Fig.2 The levels of total antibody，IgG isotypes and BALF IgA of anti-P1C from immunized mice(n=5)

图3 各免疫组小鼠支气管灌洗液中IFN-γ和IL-4水平(n=5)Fig.3 ELISA analysis of IFN-γ and IL-4 levels in BALF(n=5)

图4 Mp感染后各组肺组织病理评分(n=4)Fig.4 The HPS in the lung tissues of each group of mice inoculated with M.pneumoniae(n=4)

图5 Mp攻击后各免疫组小鼠支气管肺泡灌洗液菌落计数(n=4)Fig.5 BAL fluids colonization by M.pneumoniae after respiratory challenge with M.pneumoniae(n=4)

3 讨论

Mp为胞外寄生的病原体，其免疫主要是体液免疫。抗体对控制Mp感染有重要的作用，中和抗体能阻止Mp对呼吸道黏膜上皮细胞的粘附而阻止感染，IgG还能促进吞噬细胞的吞噬作用并阻止Mp向肺泡扩散［14］。实验结果显示，IL-2能增强P1C疫苗免疫后的总IgG以及IgG1和IgG2a亚类水平，表明IL-2能促进P1C疫苗诱发的系统体液免疫应答。

SIgA能阻止Mp感染呼吸道黏膜上皮细胞，是黏膜局部抗感染免疫最重要的抗体。P1C-IL-2融合疫苗免疫组和P1C单基因疫苗免疫组小鼠支气管灌洗液中的SIgA与对照组差异均无显著性，这表明经肌注免疫后，IL-2不能促进P1C核酸疫苗免疫后黏膜局部SIgA的分泌。

目前越来越多的研究表明，体液抗体对Mp感染的保护作用不完全。Mp可侵入宿主的组织细胞，在细胞内增殖，引起持续性感染［14］，导致脑膜脑炎、心肌炎、肾炎、动脉粥样硬化、冠心病等肺外感染和并发症。细胞免疫，尤其是CD4+Th1型细胞免疫对清除胞内持续感染的 Mp非常重要［15，16］。CD4+Th1细胞主要通过分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等细胞因子发挥细胞免疫效应，其中IFN-γ是一种至关重要的抗Mp感染的细胞因子，呼吸道黏膜局部IFN-γ的缺失可导致Mp的菌落数增高、肺组织炎症加重［17］。实验发现 IL-2能促进P1C疫苗免疫后支气管灌洗液中IFN-γ的水平，显著增强P1C疫苗诱导的细胞免疫。

为检测疫苗的免疫保护作用，实验对各免疫组小鼠感染Mp早期和晚期肺间质炎症进行检测，发现在Mp感染1～6天，P1C-IL-2疫苗免疫组小鼠的肺组织病理炎症较P1C组加重，这可能是由于P1CIL-2疫苗激发的免疫应答过强，导致肺组织出现超敏反应性炎症［18］。这种超敏反应性炎症可能与IL-2作为佐剂促进P1C疫苗分泌高水平的IL-4相关。研究表明，IL-4基因敲除小鼠感染Mp后，肺组织中支原体数量少于正常感染小鼠，肺组织炎症病理损伤减轻。因此IL-4的产生非但不能产生免疫保护，还可引起超敏反应性，加重肺组织炎症［17］。在感染9天后，疫苗免疫组小鼠的肺组织炎症较对照组减轻，这可能是由于疫苗激发的免疫保护效应所致。

用Mp攻击各免疫组小鼠，病原学检测发现P1C-IL-2双基因融合疫苗免疫小鼠感染后第1、3、6天支气管灌洗液中Mp的菌落数较P1C单基因疫苗免疫组小鼠显著减少，说明IL-2能增强P1C核酸疫苗的抗Mp感染作用。

综上所述，IL-2虽可显著增强P1C核酸疫苗的免疫保护作用和免疫应答水平，但在感染早期也诱发了较重的肺组织病理炎症。在后续研究中，我们将通过改变疫苗接种策略，如改变接种途径、减少疫苗接种剂量等进一步研究IL-2对P1C核酸疫苗的免疫佐剂作用。

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