周豪杰 聂咏梅 李晓帆 汪传喜

(广州血液中心，广州510095)

人类血小板抗原(Human platelet antigen，HPA)是由血小板膜糖蛋白携带的一类特异性抗原，具有单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，遗传表现为双等位共显性遗传［1］。HPA抗原不配合可导致一系列血小板同种免疫症的出现，如输血后紫癜 (PTP)、血小板输注无效(PTR)和新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)等［1，2］。

HPA-21w抗原位于血小板膜糖蛋白GPIIIa上，GPIIIa膜糖蛋白由位于第17号染色体长臂的GP3A基因所编码，是一个90 kD的单链蛋白［3］。HPA-21bw抗原于2010年在1例NAIT病人家系中被首次检出［4］。本文报告在中国大陆地区首次检出罕见血小板抗原HPA-21bw等位基因携带者2例。

1 材料与方法

1.1 DNA样本 调查对象为随机抽取的本血液中心200名无血缘关系的无偿血小板献血者，均为汉族并知情同意，留取静脉血样，EDTA抗凝。采用Blood Purfication DNA分离试剂盒(Promega，美国)制备基因组DNA，－20℃保存备用。

1.2 HPA-21w PCR-SSP基因分型 采用聚合酶链反应-序列特异性引物法(Polymerase chain reaction-Sequence specific primers，PCR-SSP)检测 HPA-21w等位基因。根据GeneBank基因库HPA-21w序列信息［4］，采用 Primer Premier 5.0 软件自行设计 HPA-21w的PCR-SSP引物，包括两条特异性引物和一条公共引物，引物序列为:HPA-21a:5'-ACCGGGGAGCCCTACATGATG-3';HPA-21b:5'-ACCGGGGAGCCCTACATGATA-3';HPA-21common:5'-GCCTGCACAACATTCCCTGAGGT-3'，产物长度为 204 bp。引入一对内参引物用于扩增人生长激素(Humangrowth hormone，HGH)基因［5］，序列为:HGH-F:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3';HGH-R:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'，产物长度为434 bp。

每个DNA样本扩增两个PCR反应，分别扩增等位基因HPA-21a和HPA-21b。反应体系25 μl，包括2.5 μl 10 × Buffer(TaKaRa，大连)，0.2 mmol/L dNTP(TaKaRa，大连)，1 U rTaq 聚合酶(TaKaRa，大连)，0.5 μmol/L HPA 引物，0.15 μmol/L HGH 引物，2 μl基因组 DNA 约 40 ng，补灭菌水至 25 μl。在PTC-200扩增仪(Bio-Rad，美国)进行PCR扩增，扩增参数为:95℃ 5分钟预变性;95℃ 40秒，61℃50秒，72℃ 40秒，共35个循环;72℃延伸7分钟。取8 μl产物凝胶电泳并拍照。

1.3 DNA测序 设计包含HPA-21w抗原SNP位点的正向引物5'-GGGAAGCAGAAGTGGTGGAT-3'和反向引物5'-TTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTC-3'，扩增GPIIIa编码基因的exon 11，产物长度为433 bp。PCR 反应体系 25 μl，包括 2.5 μl 10 × Buffer，0.2 mmol/L dNTP，1 U rTaq 聚合酶，引物各 0.2 μmol/L，2 μl基因组 DNA 约 40 ng，补灭菌水至 25 μl。扩增参数:95℃ 5分钟预变性;95℃ 40秒，61℃50秒，72℃ 40秒，共35个循环;72℃延伸7分钟。产物送北京华大基因公司测序。

2 结果

图1为2例代表性DNA样本HPA-21w PCRSSP基因分型格局图:每个样本包含两个泳道，分别代表HPA-21a和-21b等位基因PCR电泳结果，所有泳道在434 bp处的条带为HGH内参照，在204 bp处的HPA阳性条带表示具有相对应的等位基因，因此例1为HPA-21a/a纯合子，例2为HPA-21a/b杂合子，其余样本结果判读类同。在200例无关汉族血小板献血者分型过程中发现2例罕见HPA-21bw等位基因携带者，表型为HPA-21a/b杂合子，其余DNA样本分型结果均为HPA-21a/a纯合子。2例HPA-21bw携带者中，一例为女性，年龄32岁，B型，Rh阳性;另一例为男性，年龄22岁，A型，Rh阳性。实验中，分别3次抽提该2例杂合子DNA样本进行HPA-21w基因分型，结果均一致，为HPA-21a/b杂合子。HPA-21bw等位基因频率为0.50%。

图2为该2例HPA-21a/b杂合子及另外2例HPA-21a/a纯合子献血员DNA样本的测序结果图:例1和例2在GPIIIa编码基因1960位为G/A双峰，为HPA-21a/b杂合子;例3和例4则为G/G单峰，因此为HPA-21a/a纯合子。2例HPA-21a/b杂合子测序结果已在GeneBank注册，注册号分别为KC155823和 KC155824。

图1 HPA-21w PCR-SSP基因分型格局图Fig.1 The pattern of HPA-21w genotyped by PCR-SSP

图2 GPIIIa编码基因exon 11扩增产物DNA测序图Fig.2 DNA sequencing chromatogram of the amplified product of GPIIIa exon 11

3 讨论

目前，已有33个HPA抗原被正式命名，其中HPA-1至HPA-5以及HPA-15由于存在a和b对偶抗原而被列入6个遗传系统，其余21个HPA抗原(包括HPA-6w至HPA-14w以及HPA-16w至HPA-27w)由于对偶抗原未被检出而未达到系统标准，并在等位基因数字后加后缀w进行表示［1，6］。非系统的HPA抗原均为低频抗原，呈现出家族个体性的特点［7］，在临床中主要表现为由于胎儿携带了父亲的HPA抗原而与母亲不配合，导致母亲对胎儿的同种免疫而诱发 NAIT［7，8］。因此这些低频 HPA 抗原主要与NAIT有关，而在血小板输注中不配合的几率较小［8］。

Peterson等于2010年在1例美国NAIT病人家系中首次报道HPA-21bw抗原，其多态性是由于GPIIIa编码基因1960位G＞A单核苷酸取代，导致GPIIIa蛋白628位谷氨酸被赖氨酸取代而引起［4］。Peterson等［4］对美国人群的调查未能检出 HPA-21bw等位基因(0/100);另一项调查却显示HPA-21bw在日本人群中存在等位基因分布(0.53%，10/1 888)，并且在日本人群中发现有3例 NAIT由HPA-21bw抗原同种免疫引起，研究人员因此认为HPA-21bw是日本人群的一个特征抗原［9］。随后Peterson等［10］在美国进行的一项多人群调查显示在美国黑人、高加索人和拉丁裔人群均未检出HPA-21bw等位基因，但在亚裔人群存在HPA-21bw等位基因分布(0.56%，6/531);Peterson 等［10］还发现 1例亚裔NAIT病例与HPA-21bw同种免疫有关，并且指出首次报道的NAIT病例可能不是美国人。这些研究结果表明，HPA-21bw在亚裔人群并不局限于个别NAIT家系，而在普通人群中存在等位基因分布［9，10］。中国人群目前尚缺乏 HPA-21w 多态性调查数据，并且未有HPA-21bw等位基因报道。

本调查采用PCR-SSP法对中国人群进行了HPA-21w基因分型，结果在200例汉族血小板献血者中发现2例HPA-21a/b杂合子，经过DNA测序证实并在GeneBank注册。本项调查首次在中国大陆人群报道HPA-21bw等位基因，填补了中国人群HPA分型资料中的空白。调查显示HPA-21bw在中国人群的等位基因频率(0.50%)与日本人群相当(0.53%)，符合亚裔人群(基因频率 0.56%)的人群分布特征［9，10］。

目前中国人群未有HPA-21bw诱发NAIT的病例报道，本调查提示HPA-21bw是诱发NAIT的一个潜在抗原位点，因此在临床实践中值得关注。同时由于HPA-21bw在中国普通人群中存在等位基因分布，因此在血小板同种免疫症的诊断以及血小板输注治疗中，该抗原均具有临床意义。

1 Metcalfe P，Watkins N A，Ouwehand W H et al.Nomenclature of human platelet antigens［J］.Vox Sang，2003;85(3):240-242.

2 Bessos H，Wilson D，Metcalfe P et al.Report on the 12th international society of blood transfusion platelet immunology workshop［J］.Vox Sang，2005;89(2):105-113.

3 Rozman P.Platelet antigens.The role of human platelet allo-antigens(HPA)in blood transfusion and transplantation［J］.Transplant Immunology，2002;10(2):165-181.

4 Peterson J A，Gitter M L，Kanack A et al.New low-frequency platelet glycoprotein polymorphisms associated with neonatal alloimmune thrombocytopenia［J］.Transfusion，2010;50(2):324-333.

5 Nie Y M，Zhou H J，Fu Y S et al.The allele frequencies of HPA 1-16 determined by PCR-SSP in Chinese Cantonese donors［J］.Transfus Med，2010;20(6):376-382.

6 Sachs U J，Bakchoul T，Eva O et al.A point mutation in the EGF-4 domain of beta(3)integrin is responsible for the formation of the Sec(a)platelet alloantigen and affects receptor function［J］.Thromb Haemost，2012;107(1):80-87.

7 Feng M L，Liu D Z，Shen W et al.Establishment of an HPA-1-to-16-typed platelet donor registry in China［J］.Transfus Med，2006;16(5):369-374.

8 Norton A，Allen D L，Murphy M F.Review:platelet alloantigens and antibodies and their clinical significance［J］.Immunohematology，2004;20(2):89-102.

9 Koh Y，Ishii H，Amakishi E et al.The first two cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia associated with the low-frequency platelet antigen HPA-21bw(Nos)in Japan［J］.Transfusion，2012;52(7):1468-1475.

10 Peterson J A，Pechauer S M，Gitter M L et al.The human platelet antigen-21bw is relatively common among Asians and is a potential trigger for neonatal alloimmune thrombocytopenia［J］.Transfusion，2012;52(4):915-916.