刘 英 郭世杰 闫昆明 严超英 王明惠 王飞宇 傅连弟 韩 军

(吉林大学第一医院儿科，长春130021)

流感是最为严重的呼吸道传染病之一，在世界范围内造成极高的发病率和死亡率［1］。世界卫生组织(WHO)报道，流感的流行每年在全球造成约300万至500万例严重疾病和约25万至50万例死亡，严重威胁人类的生命健康［2］。目前，接种流感病毒疫苗被认为是预防流感发生与控制病毒传播的最佳方法［3］。迄今为止，尚无国产的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗上市。为评价国产甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫效果，我们将大连雅立峰生物制药有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗进行了动物实验研究，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病毒 本试验所用甲型H1N1流感病毒来源于英国国家生物制品检定所(NIBSC)。

1.2 疫苗 由大连雅立峰生物制药有限公司研制的甲型 H1N1流感病毒亚单位疫苗，共 9批:Y20120401、Y20120402、Y20120403 含血凝素 20 μg/ml;Y20120404、Y20120405、Y20120406 含血凝素30 μg/ml;Y20120407、Y20120408、Y20120409 含血凝素 40 μg/ml。

1.3 实验动物及鸡胚 清洁级昆明小鼠190只，12～14 g，购自大连医科大学实验动物中心;10日龄健康鸡胚，来源于封闭饲养的健康鸡群。

1.4 主要试剂 霍乱弧菌滤液(菌液):购自Sigma公司;1%红细胞悬液:由新鲜的鸡血球配制而成;压积血球:将新鲜鸡血经PBS缓冲溶液或生理盐水洗涤离心后，取下层沉淀血球即得;4个血凝单位抗原的配制:将已知血凝滴度的甲型H1N1毒种稀释为4个血凝单位的病毒悬液。

1.5 动物分组及免疫 将9批疫苗分别免疫小鼠，腹腔注射0.5 ml/只，每批疫苗又分为1针组、2针组，每组10只，2针免疫间隔1周，同时设对照组(不予免疫)。首针免疫21天后，分别采血，分离血清，同组混合进行血凝抑制抗体和中和抗体的测定。

1.6 血凝抑制(HI)抗体的测定 取待检血清25 μl，加入霍乱弧菌滤液(去除血清中的非特异性抑制素，此物质能够与红细胞表面受体结合，影响HI效价的判定)100 μl，37℃水浴16 小时后，56℃水浴50分钟，滴入压积血球，4℃冰箱中和2小时，离心后取上清。在“U”孔板上从1∶5倍起进行对倍稀释，稀释后每孔均加入25 μl 4个血凝单位抗原，室温放置60分钟。每孔加入1%红细胞悬液25 μl，振荡均匀后，置室温40分钟观察结果，以能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度的倒数为血凝抑制抗体的效价，HI抗体效价≥1∶40为阳转。

1.7 中和抗体的测定 将待检血清经霍乱弧菌滤液常规处理后进行稀释至1∶640，然后分别与100EID50病毒液等量混合，置室温中和1小时，中和后立即接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种4只，每只0.2 ml，置 33 ～35℃ 培养 72小时，冷胚，取尿囊液做直接血凝，以鸡胚尿囊液发生红细胞凝集为阳性，并以出现2个鸡胚发生感染的最高血清稀释度的倒数为血清中和抗体的效价，中和抗体效价≥1∶200为阳转。

1.8 统计学分析 采用几何均数计算各试验组小鼠的平均血凝抑制抗体效价，鸡胚半数感染法判定中和抗体效价。采用SPSS12.0统计软件进行多因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血凝抑制(HI)抗体效价比较 不同免疫次数的各组小鼠，健康状况均良好，体重均增加。血凝素含量为20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组 HI抗体效价均小于1∶40(F=1.77，P ＞0.05)。HI抗体效价≥1∶40 为阳转，故血凝素含量为20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗免疫1针组、2针组小鼠均未阳转。血凝素含量为30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的HI抗体效价均大于1∶40(F=59.85，P ＜0.01)，血凝素含量为 30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组的血凝抑制抗体效价比较，差异均无统计学意义(F=1.67，P ＞0.05，见表1)。

2.2 各组中和抗体效价比较 血凝素含量为20μg/ml的流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的中和抗体效价均小于 1∶200(F=2.39，P ＞0.05);血凝素含量为30、40 μg/ml的流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的中和抗体效价均大于1∶200(F=62.15，P ＜0.01)，血凝素含量为 30、40 μg/ml的流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组的中和抗体效价比较，差异均无统计学意义(F=2.49，P ＞0.05)，见表2。

表1 各组免疫小鼠血清的HI抗体水平Tab.1 Serum HI antibody titers of all groups

表2 各组免疫小鼠血清的中和抗体水平Tab.2 Serum neutralizing antibody titers of all groups

3 讨论

目前国际上人用流感疫苗的研究技术已较成熟，先后发展了多种疫苗制备技术，包括全病毒流感疫苗、裂解流感疫苗、亚单位流感疫苗，有效控制了流感疫情的传播。国内外的临床研究均表明，流感病毒亚单位疫苗相比全病毒疫苗和裂解疫苗，经过进一步纯化，具有更高的纯度，不含流感病毒基质蛋白和核蛋白，在良好地保留了免疫原性的前提下，接种后副反应更为轻微，尤其适用于儿童［4，5］。

与流感病毒侵袭力及免疫保护力相关的流感病毒的抗原主要有血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、核蛋白(Nuclear protein，NP)和基质蛋白 (Matrix protein，M)等［6］。研究表明，血凝素是流感病毒亚单位疫苗的有效免疫成分［7-9］。血凝素抗体能中和病毒，是最主要的保护性抗体［10］。因此，大连雅立峰生物制药有限公司研制了以血凝素为有效免疫成分的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗。通过对不同血凝素含量的流感病毒亚单位疫苗免疫小鼠后产生的血凝抑制抗体效价、中和抗体效价之间的比较，血凝素含量为30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗的免疫效果能够达到设定标准，即血凝抑制抗体效价＞1∶40，中和抗体效价＞1∶200，并且均明显优于血凝素含量为20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗。同时，通过对不同免疫次数的比较，血凝素含量为30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组对小鼠的免疫原性无差异，以上实验结论表明甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗血凝素含量直接影响其免疫原性，且血凝素含量为30 μg/ml接种1针即可达到理想的免疫效果。

本研究证实大连雅立峰生物制药有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗具有较好的动物免疫原性，为国产流感亚单位疫苗的临床试验奠定了基础。

1 Palese P.Influenza:old and new threats［J］.Nat Med，2004;10(12 Suppl):S82-87.

2 World Health Organization.Seasonal influenza［OL］.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html，2011(03);17.

3 徐 伟，翟力军，崔德军et al.医务人员计划接种季节性和甲型H1N1流感疫苗情况调查［J］.中华流行病学杂志，2010;3l(6):714-715.

4 Gerdil C.The annual production cycle for influenza vaccine［J］.Vaccine，2003;21(16):1776-1779.

5 董蒲梅，李玉秦，郑天柱et al.流行性感冒灭活亚单位疫苗和裂解疫苗的安全性和免疫原性的比较研究［J］.中华流行病学杂志，2003;24(7):570-573.

6 Taubenberger J K，Morens D M，Influenza:the once and future pandemic［J］.Public Health Rep，2010;125(Suppl 3):16-26.

7 Wang C C，Chen J R，Tseng Y C et al.Glycans on influenza hemagglutinin affect receptor binding and immune response［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(43):18137-18142.

8 Van Damme P，Arnou R，Kafeja F et al.Evaluation of non-inferiority of intradermal versus adjuvanted seasonal influenza vaccine using two serological techniques:a randomised comparative study［J］.BMC Infect Dis，2010;10:134.

9 Gildea S，Arkins S，Walsh C et al.A comparison of antibody responses to commercial equine influenza vaccines following annual booster vaccination of National Hunt horses-a randomised blind study［J］.Vaccine，2011;29(22):3917-3922.

10 邵惠训.流感疫苗的现状与未来［J］.国际病毒学杂志，2010;17(4):110-115.