侯丽丽，晏永新，张 丽

(1.山西省兽药监察所，太原 030027;2.江西新世纪民星动物保健品有限公司，南昌 330096;3.江西出入境检验检疫局综合技术中心，南昌 330002)

复方防己口服液是《中国兽药典》2010年版二部收载的“防己散”改剂型产品，具有补肾健脾，利尿除湿之功效[1]，用于治疗禽腹水综合症。为了提高复方防己口服液的质量可控性，在参考相关文献资料[2-4]的基础上，研究建立了高效液相色谱同时测定复方防己口服液中粉防己碱和防己诺林碱含量的方法。

1 材料

1.1 试验仪器及试剂 LC200高效液相色谱仪(N2000色谱工作站);超声波清洗仪;电子天平(十万分之一);乙腈、甲醇为色谱纯;去离子水自制。

1.2 对照品及样品 粉防己碱对照品(批号:110711-200507，供含测用)，防己诺林碱对照品(批号:110793-200605，供含测用)，均由中国药品生物制品检定所提供;复方防己口服液，批号:110901、110902、110903，江西新世纪民星动物保健品有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取粉防己碱对照品约10.26 mg，防己诺林碱对照品约8.92 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2052 mg/mL粉防己碱和0.1784 mg/mL防己诺林碱对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液5 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含粉防己碱0.1026 mg、防己诺林碱0.0892 mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密量取样品溶液1 mL，加水10 mL，置分液漏斗中，加入2 mL氨水混匀，用乙酸乙酯提取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，于65℃水浴蒸干，残渣用含5%氨水的甲醇溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液制备 另取不含防己药材的阴性样品，照2.2项下操作制备成阴性样品溶液。

2.4 色谱条件及系统适应性试验 Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱;乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)为流动相;检测波长为282 nm;流速为1.0 mL/min;进样量10 μL。在上述色谱条件下，粉防己碱、防己诺林碱与其他组分得到了很好的分离，且阴性无干扰。见图1-图3。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围 精密吸取对照品贮备液(粉防己碱0.2052 mg/mL和防己诺林碱0.1784 mg/mL)1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL 和10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取各对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以粉防己碱和防己诺林碱的色谱峰面积(y)，对其浓度(x，μg/mL)进行线性回归。

图1 防己诺林碱和粉防己碱混合对照品HPLC 图

结果回归方程(n=6)和相关系数分别为:粉防己碱:y=9038．7x+5932．8，R2=1;防己诺林碱:y=10479x+1858．4，R2=0．9997。实验结果表明，粉防己碱和防己诺林碱的色谱峰面积与浓度分别在20.52～205.2 μg/mL和 17.84～178.4 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5.2 重复性试验 取批号为110901的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液6份，测定粉防己碱和防己诺林碱的含量，结果粉防己碱的含量分别为0.4860、0.4932、0.5013、0.4851、0.4922、0.4927 mg/mL，防己诺林碱的含量分别为0.4273、0.4337、0.4421、0.4322、0.4335、0.4355 mg/mL，重复性 RSD 分别为1.19%和1.11%，表明方法可行，重复性好。

2.5.3 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果粉防己碱的峰面积分别为 365718.4、357752.7、362612.0、365053.2、362238.1、361062.5，防己诺林碱的峰面积分别为 346695.4、345900.5、344973.9、346700.2、343491.3、343971.7，精密度 RSD 分别为0.80%和0.40%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取新配制的一份供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、8、12、24 h 进样1 次，记录峰面积。结果，粉防己碱峰面积的 RSD为0.84%，防己诺林碱峰面积的RSD为0.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 加样回收率试验 精密量取己知含量的复方防己口服液(批号:110901)6份，每份5 mL，置10 mL的量瓶中，分别精密加入相应含量的粉防己碱和防己诺林碱对照品，加水至刻度，摇匀。精密吸取1 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，计算加样回收率，结果见表1和表2。粉防己碱平均回收率为97.32%，RSD为0.87%，防己诺林碱平均回收率为99.05%，RSD为1.65%。结果表明，本试验具有良好的回收率。

表1 粉防己碱加样回收试验结果

表2 防己诺林碱加样回收试验结果

2.6 含量测定 取批号为110901、110902、110903的三批复方防己口服液样品，按上述所述的方法进行含量测定，用外标法计算样品中粉防己碱和防己诺林碱的含量，结果如表3。

表3 三批样品含量测定结果

3 讨论

3.1 复方防己口服液由11味中药组成，成份复杂，干扰因素多。在样品处理过程中发现，当样品液pH大于10时，粉防己碱和防己诺林碱处于解离状态，用乙酸乙酯萃取能得到较高的提取率。故在样品处理中以氨水调pH后再进行提取，从实验结果看，该方法简便、快速、准确，可作为该制剂的一个定量质控标准。

3.2 在色谱条件摸索过程中发现，色谱峰峰形对流动相pH的变化较敏感，为了改善峰形的对称性，通常在流动相中添加适量三乙胺或二乙胺，但三乙胺或二乙胺的用量过大将导致流动相pH值偏高，影响色谱柱的使用寿命。为了找到合适的流动相，试验中比较了乙腈-甲醇-水-冰醋酸(40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸钠0.41g)、0.06%二乙胺的甲醇-乙腈-水(3∶1∶1)、甲醇 -乙腈 -0.002 mol/L磷酸二氢钾-二乙胺(55∶25∶20∶0.06)、0.06%三乙胺-乙腈溶液(44∶56)、乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)等展开系统，综合考虑，以乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)为流动相分离效果最为理想。

3.3 本方法准确灵敏，可作为复方防己口服液中粉防己碱和防己诺林碱的定量分析方法，为进一步制定复方防己口服液质量标准提供了依据，并对含有粉防己碱和防己诺林碱的其他产品的含量测定方法也具有一定的参考价值。

[1]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2010年版二部[S].

[2]刘永刚，刘 勇，何瑞杰，等.HPLC测定防己中防己诺林碱和粉防己碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(9):49-51.

[3]冯碧敏，叶 云，张 昊.高效液相色谱法测定防己中粉防己碱含量[J].药物鉴定，2005，14(11):36-37.

[4]饶 毅，黎 莉，刘隆洪，等.HPLC法同时测定防己药材中防己诺林碱和粉防己碱[J].中草药，2006，37(4):612-613.