王 娜，冷 弘，李 敏，臧文巧 ，王媛媛

1)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州 450001 2)洛阳职业技术学院免疫学与病原生物学教研室 洛阳 471000

细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，细胞增殖受调控机制的严密监控，不受约束的细胞增殖将导致细胞癌变。细胞周期蛋白在细胞增殖调控中发挥重要作用[1]。G1期周期蛋白Cyclin E能够与CDK2一起促进细胞周期G1/S转换，进而促进细胞分裂。临床研究[2]发现，Cyclin E基因mRNA及蛋白过表达与癌症的发生有一定关系，提示Cyclin E过表达是癌变早期事件。RNA干扰技术可以特异阻断或降低其靶向基因的表达，在抑制肿瘤生长的基础研究[3]方面取得了一定的进展。该研究旨在构建Cyclin E基因RNA干扰载体，建立其稳定转染EC9706细胞系，为深入研究Cyclin E和食管癌发生的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料人食管癌细胞株EC9706(郑州大学基础医学院实验中心保存)；pRNAT-CMV3.1/Neo载体(购自美国GenScript公司)；BamHⅠ、AflⅡ内切酶、T4 DNA连接酶、氨苄青霉素、新霉素(购自大连宝生物工程有限公司)；质粒DNA提取纯化试剂盒(购自北京天泽基因科技有限公司)；小量总RNA提取试剂盒(购自德国Qiagen公司)；荧光定量PCR试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)；鼠抗Cyclin E单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体、鼠抗GAPDH抗体(购自美国Santa Cruz公司)；LipofectamineTM2000 (购自美国 Invitrogen公司)；小量DNA胶回收纯化试剂盒(购自广州东盛生物科技有限公司)。

1.2靶向CyclinE基因siRNA的设计、合成、退火利用Dharmacon公司提供的siRNA靶片段分析设计在线软件siDESIGN Center，扫描人Cyclin E mRNA 编码序列(NM_057182.1)，经BLAST同源性分析，确定951～969位和1 122～1 140位为siRNA靶序列，合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链(ss1F、ss1R和ss2F、ss2R)，两端分别加上BamHⅠ和AflⅡ内切酶残基。4条DNA单链分别为ss1F 5’-GATCCGCAAAAGGTTTCAGGGTATTTCAAGAGAAT

ACCCTGAAACCTTTTGCTTTTTTC-3’(59 bp),ss1R 5’-TTAAGAAAAAAGCAAAAGGTTTCAGGGTATTCTCTTG

AAATACCCTGAAACCTTTTGCG-3’(59 bp)，ss2F 5’-GATCCGGACAAAGCCCGAGCAAAGTTCAAGAGACTT

TGCTCGGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59 bp)，ss2R 5’-TTAAGAAAAAAGGACAAAGCCCGAGCAAAGTCTCTT

GAACTTTGCTCGGGCTTTGTCCG-3’(59 bp)。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。去离子水70 μL溶解短发夹DNA单链，退火反应体积50 μL，退火体系如下：10×退火Buffer 5 μL，DNA单链ss1F、ss1R(或ss2F、ss2R)各22.5 μL。退火反应：95 ℃ 6 min，70 ℃ 8 min，缓慢降至30 ℃维持10 min，缓慢降至4 ℃。20 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，小量DNA胶回收纯化试剂盒回收纯化。获得DNA双链ds1、ds2。

1.3siRNA载体质粒线性化BamHⅠ和AflⅡ酶切siRNA载体pRNAT-CMV3.1/Neo，酶切体系如下：10×缓冲液5 μL，BamHⅠ 2 μL，AflⅡ 2 μL，pRNAT-CMV3.1/Neo 41 μL。37 ℃水浴2 h，70 ℃ 5 min灭活内切酶BamHⅠ和AflⅡ。10 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收大片段线性双黏siRNA载体pRNAT-CMV3.1/Neo。

1.4发卡样退火产物与siRNA载体的重组T4 DNA连接酶连接ds1、ds2与线性双黏siRNA载体pRNAT-CMV3.1/Neo。连接反应：2×Buffer 5 μL，T4 DNA连接酶1 μL，胶回收退火产物各3 μL，线性双黏siRNA载体pRNAT-CMV3.1/Neo 1 μL。4 ℃过夜连接。获得重组产物pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2。转化感受态大肠杆菌DH5α。

1.5重组质粒的筛选鉴定从终质量浓度50 mg/L氨苄青霉素LB平板上各挑取2个菌落划线接种于LB平板上，培养16～18 h，再转种入氨苄青霉素LB液体培养基，振荡培养12 h。采用北京天泽基因科技有限公司柱式质粒DNA提取纯化试剂盒分别提取转化质粒。送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6重组质粒转染EC9706细胞提取纯化pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2和pRNAT-CMV3.1/Neo-Con质粒。复苏EC9706细胞，按Invitrogen公司转染试剂LipofectamineTM2000操作说明转染EC9706细胞。转染分4组，干扰1组(转染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1)、干扰2组(转染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2)、无关siRNA对照组(转染pRNAT-CMV3.1/Neo-Con)、空白对照组(不转染任何质粒，仅用脂质体处理),18 h后，倒置荧光显微镜下观察，488 nm最大波长激发。转染12 h后，用含有400 mg/L新霉素和青、链霉素的完全培养基进行筛选培养，3～4周后得到大量稳定转染细胞进行各项检测和试验。

1.7RT-PCR检测CyclinEmRNA表达使用Qiagen公司小量总RNA提取试剂盒提取各组转染细胞总RNA，AMV逆转录成cDNA。使用宝生物工程有限公司的荧光定量PCR试剂盒扩增，Cyclin E扩增引物5’-CGGGTCCACAGGGATGCGAAGGA-3’和5’-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA-3’。内参GAPDH扩增引物5’-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3’和5’-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3’。扩增反应条件：94 ℃预变性20 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。每个标本均扩增5管，以Cyclin E的表达量与内参GAPDH表达量的比值作为Cyclin E的相对表达量。

1.8Western-blot检测CyclinE蛋白表达裂解各组细胞，用Bradford法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量。SDS-PAGE凝胶100 V，电泳1 h，转膜。置膜于25 mL封闭缓冲液中1 h。1800鼠抗Cyclin E单克隆抗体及鼠抗GAPDH，室温孵育1～2 h。12 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体，室温孵育1 h，显色。成像扫描分析系统保存图像。

1.9统计学处理采用SPSS 13.0进行分析处理, 各组细胞Cyclin E mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1靶向CyclinE基因siRNA载体构建结果

2.1.1 发卡样DNA的退火结果 ss1F、ss1R、ss2F、ss2R发卡样DNA寡核苷酸单链，退火形成DNA双链产物ds1和ds2，退火后电泳可见明亮条带，位于100 bp下接近100 bp处，与设计一致，见图1。

2.1.2 重组载体插入序列测序结果 从转化大肠杆菌DH5α细菌中提取载体质粒，对插入序列进行测序。将插入序列分别与所设计序列进行比对，序列完全相同，无碱基差异，见图2、图3。可见重组载体中插入序列与所设计序列一致，发卡样双链DNA序列成功重组到siRNA载体上。

2.2转染结果倒置荧光显微镜下观察，干扰1组、干扰2组、无关siRNA对照组可见到有绿色荧光蛋白表达，细胞呈现绿色荧光，随后逐渐增加，1周

后荧光趋于稳定；空白对照组细胞则无荧光。见图4。

图1 siRNA发卡样DNA的退火电泳结果

1：ss1F、ss1R发卡样单链DNA退火产物；2：ss2F、ss2R发卡样单链DNA退火产物；M：Marker。

图2 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1插入序列与设计序列ss1F比对结果

图3 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2插入序列与设计序列ss2F比对结果

2.3RT-PCR检测各组细胞CyclinEmRNA表达结果各组细胞Cyclin E mRNA的相对表达量见表1。

图4 倒置荧光显微镜下各组转染细胞(×200)

2.4免疫印迹结果干扰1组、干扰2组、空白对照组、无关siRNA对照组细胞在大约54 000处均有免疫印迹出现，其中空白对照组和无关siRNA对照组的免疫印迹强于干扰1组和干扰2组，见图5。

表1 各组细胞Cyclin E mRNA相对表达量比较

F=15.381，P=0.002；*与空白对照组、无关siRNA对照组比较，P均<0.05。

图5 Western-blot结果

1：干扰1组；2：干扰2组；3：无关siRNA对照组；4：空白对照组。

3 讨论

细胞的增殖是受到机体内外环境不同水平严密监控的，细胞增殖失去控制导致异常增殖则形成肿瘤[4]。周期蛋白与其他调控物质共同构成了细胞周期和细胞增殖调控的复杂网络。目前已分离的周期蛋白有数十种，在控制细胞分裂过程中执行多种多样的功能，保证细胞周期的正常运行。细胞周期蛋白在肿瘤的发病机制、基因治疗等基础研究[5-9]方面取得一定进展。

Cyclin E是一种G1期周期蛋白，是细胞能够通过细胞周期限制点“R”的一个限制因素。Cyclin E通过活化周期蛋白依赖性蛋白激酶2，级联活化其下游一系列蛋白质，促进G1/S期的转换[10-11]。在正常细胞周期中，Cyclin E的消长是受到严密控制的。Cyclin E的过度表达，导致细胞分裂不受控制，引起肿瘤[12-13]。RNA干扰技术可以特异阻断或降低其靶向基因的表达，通过抑制引起肿瘤发生的重要蛋白的表达而抑制肿瘤的生长、黏附、侵袭、耐药等能力[14-16]。研究者[17-19]从不同的角度揭示了Cyclin E基因和癌症发生的关系。

该研究设计合成了靶向Cyclin E基因的siRNA，连接入pRNAT-CMV3.1/Neo载体，成功构建了靶向Cyclin E基因的RNA干扰载体。转染人食管癌细胞CE9706后，干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较，Cyclin E mRNA的相对表达量显著降低，Cyclin E蛋白表达量明显下降。

试验结果提示，所构建的靶向Cyclin E基因RNA干扰载体在细胞内能有效降低Cyclin E 蛋白表达。为进一步深入研究所构建载体对食管癌细胞CE9706增殖、黏附、侵袭能力的影响奠定了基础。

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