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扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠多器官损伤心肌组织炎性因子表达的影响*

2013-11-14王丁超常银江苏秀平王静张韧陈晓敏河南省濮阳市中医院濮阳45700河南省濮阳市人民医院濮阳45700

江西中医药 2013年3期
关键词:乌司扶正脓毒症

★ 王丁超 常银江 苏秀平 王静 张韧 陈晓敏 (.河南省濮阳市中医院 濮阳45700;.河南省濮阳市人民医院 濮阳45700)

脓毒症(sePsis)是指微生物入侵机体致感染后,所导致的全身性炎症反应综合征。由脓毒症导致的感染性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ injury,MODS),已成为临床危重患者的重要死亡原因之一[1]。在脓毒症多器官功能衰竭的发生发展过程中炎症反应起着重要的作用,大量炎症因子的释放,使机体出现了一系列全身反应,进而导致多器官功能衰竭,心脏是最常受累器官之一,心脏局部增加的炎症因子是导致心功能障碍的重要因素[2,3]本实验以脓毒症大鼠为研究对象,通过观察扶正败毒颗粒对外周血白细胞计数、中性粒细胞及心肌炎性因子IL-1、TNF-α的影响,以阐明其对脓毒症的抗炎及心肌保护作用可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

青年SD大鼠154只,清洁级,雌雄各半,鼠龄3-4月,体质量(300±50)g,由河南实验动物中心提供(动物质量合格证号:scxk(豫)2009-0006)。

1.2 药品、试剂与仪器

扶正败毒颗粒,由濮阳市中医院中药制剂室提供,批号为20090605;乌司他丁,广东天普生化医药股份有限公司产品,批号为S19990050。IL-1单克隆抗体(批号:BA0990)及TNF-α单克隆抗体(批号:BA0962),均由武汉博士德生物工程有限公司提供。PM-10AD型光学显微镜,Olympus optical Co.LTD产品;JA1203型电子天平,上海精科天平厂产品;XS-800i型自动血液分析仪,日本希森美康公司产品。

1.3 分组与模型的建立

将SD大鼠按随机数字表法分为模型对照组、扶正败毒颗粒组、乌司他丁组及扶正败毒颗粒联合乌司他丁联合组(以下简称联合组),每组36只,另设假手术组10只。参考文献[4,5]加以改良建立脓毒症动物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后,仰卧位固定大鼠,颈部皮肤常规备皮、消毒;于颈外侧下颌至心脏的中点作1个约1 cm的横切口,钝性分离皮下组织,暴露右侧颈外静脉;沿血管向近心端方向插入留置针约1 cm,将导管从留置针管与颈外静脉夹孔中把心导管慢慢置入达右心房,结扎固定,导管末端经皮下隧道从颈后中央引出并固定于皮肤;管内注射125 U/mL肝素0.5 mL抗凝,插入置管针封闭导管;然后沿腹白线中段作3 cm切口,探查取出盲肠;用四号丝线距盲端1 cm处结扎,用12号针穿刺3孔,挤出少许粪便于腹腔内,回纳盲肠,分层缝合腹腔。假手术组的处理分别在颈部及腹部做一切口,缝合,然后按各时间点取材。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃,保持室温(26±1)℃。

1.4 给药方法

造模后第1日,假手术组、模型对照组、乌司他丁组用生理盐水灌胃,扶正败毒颗粒组、联合组用扶正败毒颗粒(36.8 mg/100g)灌胃(灌胃容积为1 mL/100g),每日灌胃1次,连续7天,直至取材;此外,乌司他丁组、联合组大鼠分别于造模后第1天腹腔内注射乌司他丁(1万U/kg),假手术组、模型对照组、扶正败毒颗粒组用同等容积的生理盐水腹腔注射,每天1次,连续7天,直至取材。

1.5 检测指标

1.5.1 外周血白细胞和中性粒细胞比率 取大鼠尾部静脉血,用XS-800i自动血液分析仪自动分析计数外周血白细胞(×109·L-1)和中性粒细胞比率(%)。

1.5.2 脏器组织IL-1,TNF-α表达 检测采用免疫组织化学SP法检测。免疫组化染色结果分析方法如下:光镜下观察,在400倍视野下,细胞膜、细胞浆呈棕色为免疫组化阳性。以光镜观察,用Image-Pro Plus 5.1专业图像采集与分析系统采集图像,并进行半定量分析。每张切片随机选取不重叠的5个视野拍照,测定其平均吸光度(A)及阳性细胞数,取其平均值代表各细胞因子的表达水平。

1.5.3 病理观察 取心肌组织4%多聚甲醛固定,经脱水、透明、浸蜡、包埋,切成4~6μm厚的切片,常规脱蜡、脱水,苏木素-伊红(HE)染色,脱水、透明、封片。光学显微镜观察心肌组织病理形态学改变。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数()标准差(s)表示,组内差异比较采用单因素方差分析,2组间比较采用t检验。以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠外周血WBC计数、中性粒细胞比率的影响

模型组各时间点大鼠外周血白细胞计数和中性粒细胞比率较假手术组显著升高(P<0.01)。扶正败毒颗粒组和乌司他丁组比模型组明显降低(P<0.05,P ﹤ 0.01),以联合 7d组的尤为显著(P <0.01)。见表1。

表1 各组大鼠白细胞计数、中性粒细胞比率比较()

表1 各组大鼠白细胞计数、中性粒细胞比率比较()

注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组比较:#P <0.05,##P <0.01;与扶正败毒颗粒组比较:△P <0.05,△△P <0.01;与 2d组比较:*P <0.05,**P <0.01;与 3d组比较:▲P <0.05,▲▲P <0.01。

组别 时间(天)动物数(只)白细胞计数(×109L-1)中性粒细胞比率(%)4.38 ±0.88 62.16 ±0.00模型对照组 2 6 12.07±1.27** 80.53±1.70**3 6 15.88 ±1.78** 91.70 ±2.46**7 6 14.58 ±1.57** 85.24 ±2.04**▲扶正败毒颗粒组 2 6 8.87 ±0.92 76.18 ±1.37 3 6 10.60 ±1.29## 82.35 ±1.69##7 6 9.17 ±1.25##**▲▲ 73.21 ±2.26##**▲▲乌司他丁组 2 6 8.25 ±0.77 77.06 ±1.60 3 6 9.33 ±1.11 80.39 ±1.45 7 6 6.75 ±1.76#△△**▲▲ 72.86 ±2.27#△△**▲▲联合组 2 6 7.07 ±1.70 74.11 ±1.22#3 6 5.63 ±1.36## 70.26 ±1.94##7 6 4.98 ±0.98##△**▲▲ 65.37 ±1.79##△**▲▲假手术组6

2.2 心肌组织TNF-α、IL-1的表达变化

假手术组心肌组织少量TNF-α、IL-1阳性表达。模型对照组心肌组织TNF-α、IL-1表达明显高于假手术组 (P<0.05或P<0.01)。与模型对照组对比,扶正败毒颗粒组、乌司他丁组的3、7天及联合组各时间点TNF-α、IL-1阳性细胞表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。各药物组3天时TNF-α、IL-1阳性细胞的表达均较2天时减弱,7天时的表达均较3天时显著减弱(P<0.05或P<0.01),以联合7天组尤为显著(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1阳性细胞表达变化(IOD,光密度单位)()

表2 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1阳性细胞表达变化(IOD,光密度单位)()

注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组比较:#P <0.05,##P <0.01;与扶正败毒颗粒组比较:△P <0.05,△△P <0.01;与 2d组比较:*P <0.05,**P <0.01;与 3d组比较:▲P <0.05,▲▲P <0.01。

组别 时间(天)动物数(只) 心肌组织TNF-α 心肌组织IL-1 2.46 ±1.12 1.97 ±1.35模型对照组 2 6 19.66 ±1.12 19.38 ±1.26 3 6 12.59 ± 2.3* 12.37 ± 1.22**7 6 10.13 ±1.08**▲ 10.38 ±2.38***▲扶正败毒颗粒组 2 6 12.77 ±1.12## 13.23 ±2.95 3 6 9.68 ± 1.54## 10.72 ±2.31#7 6 8.01 ±2.27##**▲ 8.33 ±1.58#*▲乌司他丁组 2 6 14.23 ±2.53# 15.63 ±2.63#3 6 10.93 ±1.46# 10.29 ±2.99*7 6 9.56 ±1.41##*▲ 9.11 ±1.46**▲联合组 2 6 7.49 ±1.77## 9.22 ±1.13##3 6 6.93 ± 1.88## 8.16 ±2.24##△7 6 5.88 ±1.66##△△**▲▲ 6.24 ±2.32##假手术组6△△**▲▲

2.3 病理改变

光镜下假手术组心肌组织未见明显的病理改变,心肌纤维排列规则,结构清晰,心肌细胞正常,心肌间质无充血、水肿,未见炎性细胞。模型组大鼠随着时间的延长,心肌逐渐出现病理改变,心肌纤维断裂,心肌组织排列紊乱,血管充血出血,心肌细胞间见成堆血细胞,心肌细胞肿胀或皱缩,胞核变形,心肌间质充血水肿,炎症细胞浸润,尤以3天组最明显。实验药物组心肌细胞损害较轻,心肌组织稍紊乱,可见有少量炎症细胞浸润,细胞核未见明显变化,较同时点模型组相比病理变化减轻,尤以联合7天组最明显。

3 讨论

脓毒症属中医学“伤寒”、“温病”等范畴。由于邪毒入侵或各种创伤导致正邪交争、正气耗伤、邪毒阻滞而发病。正气亏虚、浊毒内蕴、络脉瘀滞是脓毒症的主要病理机制之一。本病的病机特点为本虚标实,本虚以气虚为主势以缓,标实则以浊毒(热毒、瘀毒、浊毒)为主势以急,虚、瘀、毒交互影响,形成恶性循环。故治疗则以清热解毒、降浊化瘀为主,兼顾益气扶正。据此拟中药复方扶正败毒颗粒(由人参、生大黄、水牛角、生地黄、麦冬、玄参、石膏、知母、黄连、冰片等组成)治疗。诸药配伍,共奏解毒降浊、益气化瘀之功效。本研究表明,经过应用扶正败毒颗粒,脓毒症大鼠外周血白细胞总数及中性粒细胞比例降低,扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠具有明显的抗炎作用。

脓毒症最主要的危害是引发多器官障碍综合征(MODS)导致死亡,其本质在于由众多细胞因子和细胞黏附分子参与的失控性炎症反应及炎症反应/抗炎反应失衡[6]。炎症瀑布效应在诱导脓毒症心肌损害中占主要地位。脓毒症能够引起TNF-α、IL-1等一系列炎症介质释放。目前研究[7]认为循环中以及心肌组织产生的炎症因子如TNF-α、IL-1在脓毒症心肌损害的发生发展中起重要作用:早发型心肌损害主要由TNF-α、IL-1引起。本研究显示模型组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1表达水平均较假手术组明显上调,表明脓毒症能刺激心肌细胞,激活炎症信号通路,诱导炎症反应。因此抑制过度炎症反应、重建炎症反应和抗炎反应间的平衡是脓毒症治疗的重点。本实验结果显示,扶正败毒颗粒能够降低组织炎性因子TNF-α,IL-1表达水平,提示扶正败毒颗粒通过降低心肌组织中炎性细胞因子TNF-α,IL-1含量,进而减轻脓毒症大鼠心肌组织损伤和降低死亡率。

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