★ 陈兰英 刘辉 王昌芹 段萌 罗颖颖 刘荣华

(1.江西中医学院 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330004)

桂枝芍药知母汤对不同时间点大鼠急性足趾肿胀及炎症介质的影响*

★ 陈兰英1，2**刘辉1王昌芹1段萌1罗颖颖1刘荣华2

(1.江西中医学院 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330004)

目的：建立角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型，观察桂枝芍药知母汤对足趾肿胀的时序性影响及不同起效时间点炎症介质的影响。方法：在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜胶0.1 mL/只致炎，随后于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h各测一次足趾容积，计算足趾肿胀度和肿胀抑制率，确定最佳起效时间范围；同时研究桂枝芍药知母汤在起效时间内不同时间点对炎症介质的影响。结果：桂枝芍药知母汤高(20g/kg)、中剂量(10g/kg)在1、2、3h，而低剂量组(5g/kg)在3h都能明显降低足趾肿胀度和提高肿胀抑制率；与模型组比较，桂枝芍药知母汤组在1h时血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明显降低(P﹤0.05)，在3h 时血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌显著降低。结论：桂枝芍药知母汤抗角叉菜胶致急性炎症作用的有效时间范围是1-3h，在1h主要抑制花生四烯酸的COX-2途径，减少了PGE2、NO和TNF-a的释放，在3小时则主要抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎症介质的释放，体现了中药复方桂枝芍药知母汤抗炎作用的时序变化特点。

桂枝芍药知母汤；足趾肿胀；炎症介质；不同时间点

桂枝芍药知母汤载于张仲景所著《金匮要略》卷上，谓：“诸肢节疼痛，身体尪羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐者。”现代药理研究亦表明其具有治疗风湿性关节炎、手足浮肿，消炎止痛、调节免疫的作用[1]且临床疗效显著[2]。本文以经典的角叉菜胶诱导大鼠足趾肿胀为模型[3]研究不同时间点桂枝芍药知母汤的抗炎作用及对炎症介质的影响，为本方的临床应用提供科学合理的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 桂枝芍药知母汤处方药材饮片购于江西中医学院姚荷生研究室门诊部，经鉴定符合2010版《中华人民共和国药典》一部相应标准，将药材加入适量的冷蒸馏水浸泡0.5h，然后用武火加热，待沸腾后再用文火煎煮40min，重复3次，合并3次水煎液，过滤，浓缩储藏备用；吲哚美辛(indomethacin)购于广东华南药业集团有限公司。

1.2 实验动物 SPF级SD大鼠40只，体重(160±15)g，雄性，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK(湘)2009-0004。

1.3 试剂 λ-角叉菜胶(λ-carrageenan)购于sigma公司，提前1d用生理盐水配置为1%(w/v)的溶液；戊巴比妥钠使用时配置为2%的生理盐水溶液；大鼠髓过氧化物酶(MPO)、大鼠前列腺素E2(PGE2)、大鼠环氧化酶-2(COX-2)检测试剂盒均购于上海西唐生物科技有限公司(进口分装)；大鼠白介素-1β(IL-1β)、大鼠肿瘤坏死因子a(TNF-a)ELISA试剂盒购于上海依科赛生物制品有限公司；一氧化氮(NO)一步法测试盒购于南京建成。

1.4 仪器 YLS-7B足趾测定仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；Thermo Multiskan Mk3酶标仪 (芬兰)；t10/t18/t25 ika匀浆机(德国)；Hettich Mikro 22R冷冻离心机(德国)。

1.5 方法[3]将40只大鼠适应性喂养3d后，按体重随机区组分为5组，即模型组、阳性给药组、桂枝芍药知母汤高剂量组、桂枝芍药知母汤中剂量组、桂枝芍药知母汤低剂量组。模型组灌胃给予相应体积生理盐水，阳性组灌胃给予9mg/kg的吲哚美辛；高剂量组灌胃给予20g/kg的桂枝芍药知母汤水煎液， 中剂量组灌胃给予10g/kg的桂枝芍药知母汤水煎液，低剂量组灌胃给予5g/kg的桂枝芍药知母汤水煎液。所有大鼠在左后肢踝关节周围做一标记,测量每只大鼠正常足趾容积(V0)。给药0.5h后，立刻给每只大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥钠 2mL/kg进行麻醉，麻醉后在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜胶(1%，W/V)0.1 mL/只致炎角交菜胶诱导足趾肿胀模型建立及。

1.5.1 肿胀程度测定及肿胀抑制率计算[4,5]致炎后，于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h各测一次足趾容积(Vt)，观察不同时间肿胀度的变化(Vt-V0)，并按下面公式计算肿胀抑制率。

1.5.2 桂枝芍药知母汤在检测时间点对炎症介质的影响比较 根据大鼠时间-足趾肿胀程度测定结果，选取桂枝芍药知母汤对足趾肿胀抑制率有显著作用的时间点来检测其对不同炎症介质变化的影响。各组在检测时间点取肿胀的后足趾进行匀浆，3 000转低温离心，取上清于-80℃冻存备用。为了保证组织匀浆内含物活性，以上所有操作都在冰浴中完成，分别测定了肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、白介素IL-1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、环氧化酶-2(COX-2)、髓过氧化物酶(MPO)。以上各指标测定根据所购买的试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 桂枝芍药知母汤对大鼠足趾肿胀的影响 桂枝芍药知母汤对大鼠足趾肿胀有明显抑制作用，且高、中剂量在1、2、3h有明显作用；低剂量组在3h具有显著作用，4h后桂枝芍药知母汤对足趾肿胀无明显影响(详见表1)。

表1 桂枝芍药知母汤对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀度影响(抑制率%)±S，n=8)

2.2 桂枝芍药知母汤在不同检测时间点对炎症介质的影响比较 根据大鼠时间-足趾肿胀程度测定结果，选取桂枝芍药知母汤对足趾肿胀抑制率有显著作用的时间点(1h和3h)来检测其对不同炎症介质变化的影响。结果显示桂枝芍药知母汤在不同检测时间点对不同炎症介质含量影响不同。与模型组相比，在抗1h，给药组大鼠血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明显降低(P﹤0.05)；而在3h 时，给药组大鼠血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌显著降低(详见表2)。

表2 桂枝芍药知母汤在不同检测时间点对角叉菜胶所致足肿胀炎症介质变化的影响±S，n=8)

3 讨论

当机体组织受到化学、物理损伤、炎症因子刺激时从两方面产生致炎作用[6,7]：一方面激活细胞磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)水解细胞膜磷脂，生成花生四烯酸(arachidonic acid,AA)诱导COX-2的产生，其主要作用是把花生四烯酸转变为前列腺素类物质(Prostaglandins,PGs)，其中PGE能够传张小血管，增高微血管通透性促进水肿发生，在较高浓度时显示趋化效应，吸引中性粒细胞转移到损伤组织。另一方面[8]刺激白介素(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)等细胞因子的分泌，从而促进内皮细胞表达粘附分子，加速白细胞与之粘附，引起急性炎症、发热等症状。髓过氧化物酶[9](myeloperoxidase，MPO)又称为过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞和单核细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态，反应了炎症的严重情况，MPO在局部组织内越多则代表炎症反应越严重。

本实验研究表明桂枝芍药知母汤对角交叉胶诱导的足趾肿胀有明显抑制作用，该作用主要是在不同时间通过对不同炎症介质的影响而实现的，且在1-3h与模型组比较有明显差异，其中有最大差异的时间点即1h时则抑制了主要的炎症发展通路即花生四烯酸的环氧化酶途径，减少COX-2的产生，进而减少了前列腺素类物质等炎症介质的释放，而在3h时则抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎症介质的释放。体现了中药复方桂枝芍药知母汤抗炎作用的时序变化特点，可能与桂枝芍药知母汤不同有效成分在不同时间点发挥作用有关，桂枝芍药知母汤有效成分在体内的变化及对不同炎症介质的作用有待进一步研究。

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EffectofGuizhiShaoyaoZhimuDecoctiononAcuteSwellinganditsInflammatoryMediatorsatDifferentTimePoints

CHENLan-ying1,2,LIUHui1，WANGChang-qin1,DUANMeng1,LUOYing-ying2，LIURong-hua1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;2.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,Nanchang330006,China

Objective: To study Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction on anti-inflammatory effect and inflammatory mediators release by establishing acute inflammatory model induced by λ- carrageenan. Method: After injecting λ- carrageenan 0.1 ml into each rat left hind toe subcutaneously，toe volume was measured at 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10h，then toe swelling degree and change of inflammatory mediators were determined at different time points. Results: The high and medium dose Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction could significantly reduce the swelling degree and improve the swelling inhibition rate at 1，2，3 hours，but the low dose medicine had obvious effect at 3 hour；Compared with the model group，serum COX-2, PGE2, TNF-a and NO on Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction group were obviously decreased at 1hour(P<0.05)，while serum IL-1 (P<0.01), MPO (P< 0.05), TNF-a (P<0.01), PGE2(P<0.01) decreased at 3hour. Conclusion: The therapeutic time of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction is 1-3 hours on acute inflammation induced by carrageenan. At 1 hour，it might interfere with COX-2 pathway of arachidonic acid (AA) metabolism and reduced release of NO，TNF-a，PGE2，but at 3 hour it inhibited the release of inflammatory mediators IL-1 β, TNF-a, PGE2and MPO. The result reflects the time-effect relationship characteristics of Chinese Medicine Compound Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction.

Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction(桂枝芍药知母汤); Toe Swelling ; Inflammatory Mediators ; Different Time Points

国家自然科学基金资助课题(项目编号：81060373)。

**通讯作者：陈兰英，女，博士，教授，研究方向：中药药效评价及作用机制研究，E-mail:cly2513@163.com。

R 285.5

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2013-07-06)