★ 邹志坚 高增光 王晓敏** 席晓甜

(1.南昌大学第四附属医院肿瘤科 南昌 330002；2.江西中医学院 南昌330004)

姜黄素对肺腺癌A549细胞PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的作用*

★ 邹志坚1高增光2王晓敏2**席晓甜2

(1.南昌大学第四附属医院肿瘤科 南昌 330002；2.江西中医学院 南昌330004)

目的：研究姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖率、凋亡和PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响。方法:采用细胞计数法绘制肺腺癌A549细胞生长曲线，MTT法测定姜黄素对肺腺癌A549细胞抑制率。将不同浓度姜黄素作用于肺腺癌A549细胞24h后,显微镜下观察细胞形态；TUNEL法检测细胞凋亡率；免疫组化法检测PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达。结果：姜黄素能够抑制肺腺癌A549细胞增殖, 且呈一定剂量和时间依赖性；随着药物浓度上升细胞凋亡率明显增高(P<0.05)；PI3K、Akt和Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖具有抑制作用,其作用可能是诱导细胞凋亡及抑制PI3K/Akt/Bcl-2信号通路来实现的。

姜黄素 PI3K/Akt/Bcl-2 肺腺癌A549细胞

肺癌已是世界上发病率及死亡率较高的恶性肿瘤之一，绝大数肺癌患者被诊断时已不适合手术治疗，放化疗及分子靶向治疗成为其主要的治疗手段，但长期使用毒性大费用高又影响其疗效[1]。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学功能，是一种高效、低毒，能抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡的天然药物，但其作用机制尚不清楚[2]。PI3K /Akt/Bcl-2通路被认为是癌细胞存活的首要通路，该信号转导通路的异常导致细胞异常增殖引起肿瘤。本课题研究姜黄素在体外对肺癌A549细胞的作用并通过检测PI3K/Akt/Bcl-2表达改变从分子水平探讨其机制。

1 材料

1.1 药材 姜黄素纯品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)、胰酶均为美国Sigma公司；肺腺癌细胞株A549由本室保存，由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤生物学检测中心提供；RPM I1640培养基为Gibco公司产品；PI3K、Akt、Bcl-2一抗为北京中杉金桥公司；胎牛血清为杭州四季清公司产品；TUNEL为武汉博士德公司产品；其余试剂均为国产分析纯。姜黄素用DMSO溶解配制成终浓度为50mg/L的母液，过滤除菌，避光存储于-20℃备用,每次实验前用培养液稀释至所需浓度 (DMSO终浓度< 1 /1000)。

1.2 仪器 电子分析天平(瑞士 梅特勒-托利多)；PH140A型培养箱/干燥箱(上海-恒科技有限公司))；CO2培养箱(美国 Forma Scientific)；酶标仪(美国Multiskan)；UV-2102紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；徕卡DL2500显微镜(德国徕卡)；徕卡CCD图像采集系统(德国徕卡)；Image-Pro Plus 6.0(美国冷泉公司)。

2 方法

2.1 细胞培养和药物处理 肺腺癌A549 细胞加入含10%小牛血清、青霉素及链霉素各100U/mL的RPMI-1640培养液中，37℃、5% CO2培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期。更换含0、6.25、12.5、25、50mg /L姜黄素新鲜培养液，用顺铂(DPP，25mg /L )为阳性对照组。

2.2 细胞增殖抑制试验(MTT法) 将对数生长期肺腺癌A549 细胞移入96孔培养板中, 细胞密度约为1.0×105/mL,每孔加入200μL细胞悬液, 培养24h。吸弃孔内原培养液, 加入含姜黄素的10% 胎牛血清RPM I1640培养液200μL, 每个药物浓度设4个平行复孔, 另设顺为阳性对照组和空白对照孔。姜黄素各浓度组药物作用时间分别为12、24、48、和72h, 培养至倒数4h ,每孔加入MTT (5mg /mL) 20μL, 继续培养4h后终止培养, 小心吸弃孔内上清液, 每孔加DMSO150uL，用震荡混合仪震荡10min，使结晶充分溶解。选择492nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)，实验重复4次。按下公式计算抑制率∶抑制率(%) = ( 1 -实验组OD值/对照组OD值)×100%。并求出IC50 (细胞抑制率为50% 时的药物浓度)。

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用48h后，收集各组细胞，用PBS漂洗2遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15min；细胞在渗透液( 0.2% Triton X -100，0.1%柠檬酸钠)中孵育5min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃ 湿盒中孵育30min；滴加转化剂，37℃湿盒中孵育30min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5-10min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照片。以核呈棕黄褐色为阳性细胞，即凋亡细胞，而阴性细胞核着蓝色。利用Image-Pro Plus 6.0(美国冷泉公司)分析系统进行分析。随机计数每组细胞低倍镜下10个视野中的阳性细胞数及总细胞数，进而得出每组细胞的阳性率。

2.4 免疫组化法检测PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达 按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞48h后，收集各组细胞，PBS冲洗两次,制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15min；3%过氧化氢孵育5min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加PI3K/Akt/Bcl-2一抗(稀释1∶100-200)，室温90min，PBS 冲洗, 3min×3次；滴加IgG抗体- HRP多聚体20-30min，PBS冲洗5min×3次；用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

3 结果

3.1 MTT检测结果显示： 6.25-50mg/L姜黄素和顺铂处理肺癌A549细胞12、24、48、72h后均能明显抑制细胞的增殖活性，且在一定范围内有剂量和时间依赖性，与培养基对照组相比有显著性差异(P<0.05)。而25、50 mg /L姜黄素处理肺癌A549细胞72h后，对其增殖抑制作用不明显。见图 1。

图1 不同浓度姜黄素对肺癌抑制的影响

3.2 姜黄素对A549细胞的细胞毒作用： 不同浓度姜黄素作用A549细胞后，倒置光学显微镜下观察：对照组细胞呈梭形或多边形，细胞贴壁生长，细胞透亮折光性好，细胞增殖旺盛。而在12.5、25mg /L剂量组，细胞数减少，呈梭形或少许圆形贴壁生长,细胞形态欠规则，且随着药物浓度增加和作用时间延长而愈加明显。50mg /L剂量组细胞折光性差，明显增大，轮廓模糊，胞内空泡增多，部分坏死漂浮培养液中。

3.3 姜黄素对A549细胞凋亡的影响 TUNEL 检测结果显示, 正常对照组、12.5mg /L姜黄素组、25mg /L姜黄素组、50mg /L姜黄素组和 DDP组的阳性细胞的百分率 (凋亡率)分别为(4.22±0.15)% 、(13.14±1.45)% 、(17.72±2.68)% 、(23.54±3.76)% 和 (32.32±4.38) % ，各浓度姜黄素组A549细胞凋亡率显著高于正常对照组 (P< 0. 05) 。

3.4 姜黄素对A549细胞PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达的影响 免疫组化检测结果显示，姜黄素处理A549细胞24h后, 与对照组相比，各浓度姜黄素组PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05)。见表 1。

表1 姜黄素对A549细胞PI3K/Akt /Bcl-2蛋白表达的影响

4 讨论

姜黄素(Cureumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(Cureumalonga)根茎中提取的一种酚类色素，大量研究表明姜黄素具有抗炎、抗肿瘤等多种生物学功能。最近美国NCI已将其列为第三代防癌药，进行大量临床研究。大量研究发现姜黄素对人肝癌细胞、人肾癌细胞和结直肠癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞生长等都具有明显的抑制作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡，具有广泛抗肿瘤作用[3,4]。本实验用 MTT法检测姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用, 结果显示姜黄素对肺腺癌A549细胞具有较强的杀伤能力, 且呈一定的剂量-时间依赖性。TUNEL法检测发现, 肺腺癌A549细胞凋亡率随着药物浓度增高而明显上升。本实验通过免疫组化检测PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达变化, 结果显示随着药液浓度的升高, 而PI3K/Akt/Bcl-2蛋白表达减弱。提示姜黄素抑制抗凋亡基因Bcl- 2的表达。

肺癌的发生、发展与细胞增殖失控有关和凋亡的相对减少密切相关，肿瘤细胞通过抑制凋亡来实现克隆性增生。Bc1-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。在大多数正常机体组织中Bcl-2表达很低，而在肿瘤细胞中Bcl-2表达增高，而且恶性程度越高，Bcl-2表达也越高，肿瘤细胞越易出现凋亡抑制[5]。在真核生物的调控网络中普遍存在，PI3K/Akt通路被认为是癌细胞存活的首要通路，该信号转导通路的异常导致细胞异常增殖引起肿瘤[6]。非小细胞肺癌中PI3K/Akt/mTOR信号转导途径相关基因表达水平明显上调[7]。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白，直接被PI3K 激活，可上调抗凋亡基因的表达，抑制由c-myc诱导的细胞凋亡，或活化细胞内其他信号转导通路，调节细胞的适应性生存[8]。PI3K /Akt活化后可通过抑制核转录因子(NF-kB)的转录活性、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(CREB)等诱导Bcl-2基因的表达[9]。从本实验结果提示姜黄素可能通过抑制PI3K /Akt信号通路蛋白的表达, 达到下调凋亡抑制Bcl-2蛋白, 以及解除其对促凋亡基因或因子的抑制作用, 从而促使肺腺癌A549细胞凋亡。

总之, 姜黄素具有诱导肺腺癌A549细胞凋亡作用, 其机制可能Bcl- 2基因表达有关，并通过抑制PI3K /Akt信号通路来实现，其确切机制有待深入研究。

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EffectofCurcuminonPI3K/Akt/Bcl-2PathwaySignalingLungAdenocarcinomaCellA549

ZOUZhi-jian1，GAOZeng-guang2，WANGXiao-min2，XIXiao-tian2

1.Departmentofoncology，ThefourthAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330002；2.Schoolofbasicmedicalsciences，JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004

Objective：To explore the effect of curcumin on PI3K/Akt/Bcl-2 Pathway Signaling of lung adenocarcinoma cell A549.Methods：Cell counting was used to plot the cell growth curves of A549 cells. The inhibition rate of A549 cell in different concentrations of curcumin were measured by MTT assay. After the cells were treated with curcumin，cellular morphology was observed under microscope. The apoptosis rate was detected by TUNEL. PI3K/Akt/Bcl-2 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining. Results：Curcumin could restrain the proliferation of A549 cells and inhibitory effect was dose-and-time-dependent. The rate of apoptosis increased significantly with the increasing concentrations of the drug, The expression of PI3K/Akt/Bcl-2 proteins were decreased significantly(P<0.05). Conclusion：Curcumin exerts inhibitory effects on proliferation of A549 cells possibly through inducing cell cycle apoptosis and inhibition of PI3K/Akt/Bcl-2 pathway signaling.

Curcumin；PI3K/Akt/Bcl-2；Lung Adenocarcinoma Cell A549

江西省卫生厅科技项目(项目编号：20131104)。

**通讯作者：王晓敏，女，江西余干人，博士，副教授，研究方向：从事中药对肿瘤防治研究，E-mail：wangxm2001@163.com 。

R 285.5

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2013-07-27)