李从镇，毛 宁*，黄铭杰，管雅静，耿宝荣

（福建师范大学 生命科学学院，工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350108）

灰黄霉素是展青霉产生的一种含氯的次生代谢产物[1]，能抑制真菌生长的非多烯类抗生素，其作用机理是能强烈抑制真菌细胞有丝分裂前中期或后期纺锤体微管运动，从而抑制细胞周期进程[2-3]。灰黄霉素不仅普遍应用于临床治疗皮肤和角质层真菌感染[4-6]，而且在农业植物保护方面也有着广泛的应用[7]。

目前，灰黄霉素主要通过液体发酵生产获得，液体发酵周期长，耗能大，成本较高。随着灰黄霉素在农业上的需求量不断增加，如何以最低成本产出大量灰黄霉素是科研工作者急需考虑的问题[8]。固态发酵是在固态培养基质上培养微生物的一种发酵方式[9]，灰黄霉素是细胞内代谢产物，采用固态发酵后菌丝体中的产物易于分离提取，具有简单易行，节约耗能，易推广，成本低等特点[10]。本实验室通过对灰黄霉素工业生产菌株FS80-1进行多代紫外线-氯化锂、半导体激光等方法诱变，获得2株突变株[11-12]，其中展青霉（Penicillium patulum）LD100-1是较适合固体培养的。本实验拟通过对展青霉LD100-1进行固态发酵培养基和培养条件的优化，在为进一步探究灰黄霉素的固态发酵生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

展青霉（Penicillium patulum）LD100-1：福建师范大学工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基：蔗糖30g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33.0g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.01g/L，KH2PO41.0g/L，琼脂20g/L，pH值自然。

种子培养基：大米粉50g/L，NaCl2.0g/L，CaCO38.0g/L，（NH4）2SO41.0g/L，KH2PO44.0g/L，KCl1.0g/L，NaNO31.0g/L，FeSO41.0g/L，pH值自然。

大米孢子培养基：①基础培养液：蔗糖40g/L，NaNO32.0g/L，KCl 4g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.01g/L，KH2PO40.5g/L，pH值自然。②大米/基础培养液=1∶0.8的比例煮沸30min，取出后装茄子瓶，每瓶30g，121℃灭菌30min。

1.2 样品处理和计算公式

1.2.1 种子液的制备

将活化好的展青霉斜面菌种接种到种子培养液中，220r/min、28℃摇床培养40h。

1.2.2 灰黄霉素含水量及效价的测定

将适量发酵湿料放于培养皿中置于105℃恒温烘箱烘干至质量恒定，记录烘干前后质量，计算含水量。含水量计算公式：

取5g固态发酵湿料浸泡于100mL无水乙醇30min，采用重氮盐法[13]测定灰黄霉素的效价，结果以平均值±标准差表示。灰黄霉素效价计算公式：

1.3 固态发酵培养基的优化

1.3.1 碳源的筛选

分别以晚籼米、玉米渣、小麦仁、燕麦仁、小米、麸皮作为固态发酵碳源基质，按大米孢子培养基质量（每瓶30g）的8%接种，搅匀，28℃培养14d，测定灰黄霉素效价。

1.3.2 氮源的筛选

用晚籼米作为碳源基质，分别以玉米浆粉、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3、尿素作为固态发酵培养基中的氮源（2g/L）进行固态发酵，28℃培养14d，测定灰黄霉素效价。

1.3.3 料液比对灰黄霉素效价的影响

以硝酸钠为氮源，将晚籼米与基础培养液按照不同的比例混匀，分别为1∶0.7、1∶0.75、1∶0.8、1∶0.85、1∶0.9共5个梯度，28℃培养14 d，测定灰黄霉素效价。

1.3.4 氯离子浓度对灰黄霉素效价的影响

按晚籼米/基础培养液=1∶0.8的比例，探讨NaCl、KCl以及NaCl+KCl三种不同的Cl-添加方式对灰黄霉素效价的影响。

1.3.5 填充物（木薯渣）对灰黄霉素效价的影响

在固态发酵培养基中加入不同含量的木薯渣（0、0.1%、0.2%、0.3%），考察不同木薯渣添加量对灰黄霉素效价的影响。

1.4 固态发酵条件的优化

1.4.1 种龄对菌株产灰黄霉素的影响

将种子液分别培养24h、30h、38h、46h、54h后按8%接种量接种于大米孢子培养基中，28℃培养14d，测灰黄霉素效价。

1.4.2 接种量对产灰黄霉素的影响

分别以5%、8%、10%、12%、15%的接种量，接种于大米孢子培养基中，考察不同的接种量对菌株产灰黄霉素效价的影响。

1.4.3 发酵温度与变温发酵方式对产灰黄霉素的影响

以500mL三角瓶为发酵反应器，物料厚度1.5cm，采用20℃、25℃、28℃、33℃、37℃ 5个不同温度培养LD100-1菌株，从中选择最适宜发酵温度为恒温培养对照，继续进行1d～7d 28℃培养，7d～14d 25℃培养的变温发酵。

1.4.4 发酵周期试验

在上述最佳条件下，每天取样测定灰黄霉素效价。

2 结果与分析

2.1 LD100-1菌株固态发酵培养基优化

2.1.1 碳源基质的筛选

以晚籼米、玉米渣、小麦仁、燕麦仁、小米、麸皮分别作为碳源基质发酵产灰黄霉素效价，结果见图1。由图1可看出，以晚籼米为碳源时菌株LD100-1灰黄霉素效价明显高于其他碳源，故选择晚籼米作为下一步进行固态发酵试验的碳源基质。

图1 不同碳源对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响(n=3)Fig.1 Effect of different carbon source on griseofulvin production

2.1.2 氮源的筛选

选取8种不同的有机氮源和无机氮源，探究LD100-1菌株最适的氮源，结果见图2。由图2可以看出，蛋白胨和NaNO3对产灰黄霉素的效果最好，但考虑生产成本，选择NaNO3作为LD100-1发酵最适的氮源。

图2 不同氮源对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响(n=3)Fig.2 Effect of different nitrogen source on griseofulvin production

2.1.3 培养基料液比对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

将培养基的料液比分别调至1∶0.7、1∶0.75、1∶0.8、1∶0.85、1∶0.9，结果见图3。由图3可以看出，初始料液比为1∶0.75时，灰黄霉素效价最高，故选择初始料液比为1∶0.75。

图3 料液比对灰黄霉素产量的影响(n=3)Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on griseofulvin production

2.1.4 氯离子种类与浓度对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

分别添加NaCl、KCl和NaCl+KCl 3种方式提供Cl-，对灰黄霉素效价影响见图4。由图4可知，单独加NaCl作为培养基中氯离子来源的效果好于其他2种，当Cl-浓度为0.188mol/L时（即NaCl质量浓度为11g/L），灰黄霉素效价最高，故调整单独添加1.1%的NaCl。

图4 不同氯离子种类与浓度对灰黄霉素效价的影响(n=3)Fig.4 Effect of the Cl-concentration on griseofulvin production

2.1.5 疏松剂木薯渣添加量对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

添加不同量木薯渣作为疏松剂对灰黄霉素效价的影响见图5。由图5可以看出，木薯渣会影响到基质的通气量，当木薯渣添加量为0.2%时，灰黄霉素效价比没有添加木薯渣的提高了44.4%，故可以添加0.2%木薯渣作为LD100-1固态发酵的疏松剂。

2.2 LD100-1菌株固态发酵条件的优化

2.2.1 种龄对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

分别选择培养24h、30h、38h、46h、54h的种子液来接种固体培养基，结果（图6）可见，接种培养44h种龄的种子液，产灰黄霉素效价最高，故选择种龄为44h。

2.2.2 接种量对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

分别以5%、8%、10%、12%、15%接种量接种于大米孢子培养基，结果（图7）可知，接种量为10%时，LD100-1菌株产灰黄霉素效价相对最高，故选择接种量为10%。

图5 木薯渣添加量对灰黄霉素产量的影响(n=3)Fig.5 Effect of the amount of cassava residue on griseofulvin production

图6 种龄对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响(n=3)Fig.6 Effect of seed age on griseofulvin production

图7 接种量对灰黄霉素效价的影响(n=3)Fig.7 Effect of inoculum size on griseofulvin production

2.2.3 发酵温度与变温发酵对LD100-1菌株产灰黄霉素的影响

由图8可以看出，在20℃、25℃、28℃、33℃、37℃ 5个不同温度条件下，展青霉LD100-1菌株在28℃产灰黄霉素效价最高，进而以28℃恒温发酵为对照，进行1d～7d、28℃与8d～14d、25℃变温发酵。结果（图9）可见，28℃恒温发酵灰黄霉素效价为88499μg/g（干质量），变温发酵灰黄霉素效价为10599μg/g（干质量），变温发酵比恒温发酵灰黄霉素效价提高了16.51%，说明在发酵中后期，产次生代谢物时降低温度有利于灰黄霉素的生成，变温发酵方式一定程度上优于恒温发酵。

图8 发酵温度对灰黄霉素效价的影响(n=3)Fig.8 Effect of fermentation temperature on griseofulvin production

图9 变温发酵对产灰黄霉素效价的影响比较(n=3)Fig.9 Comparison between two different temperature fermentation modes on griseofulvin production

2.2.4 固体培养发酵周期的选择

由图10可以看出，LD100-1菌株发酵周期试验的第9d～13d，灰黄霉素效价和固态发酵料的含水量均呈递增趋势，14d时，效价达最大，故选择14d作为固态发酵周期。

图10 固体培养发酵周期的选择(n=6)Fig.10 Selection of solid fermentation period on griseofulvin production

3 结果与讨论

通过对LD100-1菌株固态发酵培养基及培养条件优化，获得最佳固态培养基参数为氮源NaNO32g/L，氯离子NaCl 11g/L，碳源晚籼米∶基础培养液=1∶0.75，每瓶30g并添加0.2%木薯渣；最适培养条件：选取培养44h的种子液以10%的接种量接种，培养14d。展青霉LD100-1菌丝体生长的最适温度为28℃，但其产灰黄霉素的最适温度与菌丝体最适生长温度不同，应为25℃，因此需要采用变温的发酵方式1d～7d、28℃，8d～14d、25℃。变温发酵可使其灰黄霉素产量提高16.51%，这结果也可作为液体发酵产灰黄霉素的参考数据。

培养基及培养条件优化后，在低物料厚度条件下，灰黄霉素效价从原来的100000μg/g提高至160000μg/g，该结果说明灰黄霉素产生菌的生长代谢是需要高空气量，氧气对其产生次级代谢产物有着至关重要的作用，当物料厚度从1.5cm增至2.0cm时，同等条件下，灰黄霉素效价降至119000μg/g，因此从生产上可考虑添加适当的疏松剂，以提高空气的流通性。采用木薯渣作为疏松剂，虽能在一定程度上增加固态基质的空隙，有助于提高灰黄霉素的产量，但其不是最适的疏松剂，关于疏松剂的选择，还有待于今后进一步的筛选。

灰黄霉素效价的检测可采用重氮盐显色法、高效液相色谱法及超高效液相色谱[14-15]，本试验在检测过程中发现，HPLC的检测结果比重氮盐显色法略低，结果更准确，但其需要贵重的仪器设备，而重氮盐显色法仅需普通的分光光度计，操作也相对简单。超高效液相色谱能在短时间内测定大量的样品，在诱变育种和条件试验时色谱法特别好用。根据实际条件和需要，选择不同的检测方法均是可以的。

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