大孔树脂HPD300分离纯化樟树果色素的研究

2013-09-22崔夫知董新荣夏东海何丽娜

中国酿造 2013年12期

崔夫知，李霞*，董新荣，夏东海，何丽娜

（湖南农业大学理学院，湖南长沙 410128）

樟树是我国特产的经济树种，树干、枝叶及果实中含有多种具有应用价值的化合物。如果实中的樟油是香料香精、医药和日用化工的重要原料[1]。成熟的樟树果为紫黑色，含有大量的原花青素[2]。原花青素是一种有着特殊分子结构的聚多酚类混合物[3]，具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变以及美容等功效[4]。原花青素还可清除体内的自由基，具有良好的抗氧化活性[5-6]。有关原花青色素的提取分离的研究较多，主要提取方法有水提取法、传统溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2萃取法、酶提取法[7]，分离纯化方法有溶剂分级精制[8]、吸附层析法[9]。目前，人们对樟树果紫色素的研究还较少。文赤夫等[10]报道樟树果中原花青素具有较好的清除自由基的效果。桂克印等[11]报道酸性水提取、D406树脂吸附、pH6的酸性乙醇洗脱纯化樟树果色素的方法。

本实验采用常温条件下超声波辅助乙醇提取新鲜樟树果肉中的紫色素，进一步以大孔树脂HPD300进行吸附，再用体积分数30%的乙醇洗脱得到紫色素产品。全过程不添加酸性物质，有利于保证产品的纯天然性，而且样品中原花青素含量高，为樟树果中的原花青素的开发利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟树果11月下旬采摘于湖南农业大学校园内，洗净去核取果皮。HPD100、HPD100A、HPD300、HPD400、HPD600、HPD750大孔吸附树脂：河北宝恩生物科技有限公司；原花青素（纯度≥98%）对照样品：长沙三福生物科技有限公司。

香草醛、乙醇、甲醇、盐酸、香草醛等试剂：天津市科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SHZ-B水浴恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；SB25-12DTN超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司；AX-200型万分之一电子天平：日本Shimadzu Philippines公司）；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；UV-160可见光分光光度计：北京瑞利分析仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制及样品的测定

（1）标准溶液的配制

准确称取原花青素对照样品3.21mg，甲醇溶解，转入25mL容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，配制成原花青素标准储备溶液，浓度c=0.1284mg/mL。

（2）显色溶剂的配制

由A液和B液两种显色剂按1∶1的体积比混合配成，现配现用。A液（1%的香草醛溶液）：称取0.5g香草醛用甲醇溶解并定容至50mL，摇匀备用；B液（8%的浓盐酸）：量取4.0mL浓盐酸，用甲醇定容至50mL，摇匀备用。

（3）标准曲线的绘制

分别移取1.5mL、2.5mL、3.5mL、4.5mL、5.5mL原花青素标准溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，得到系列对照样溶液。然后，分别移取此系列溶液1mL于比色管中，同时另取1mL甲醇为空白对照，精密加入5mL显色剂。摇匀，避光，在30℃恒温水浴显色30min，冷却后在波长494nm处测定吸光度值。以吸光度值（Y）对质量浓度（x）作标准曲线。

（4）样品的测定

称取样品适量，甲醇溶解，定容。按（2）、（3）方法测定吸光度值，然后计算物质的量。

1.3.2 樟树鲜果肉中原花青素的提取与上样溶液的制备

称取新鲜去核樟树鲜果肉150g，用70%vol乙醇300mL浸泡15min，25℃超声提取10min，过滤，收集滤液。滤渣再重复提取两次，合并3次提取后的滤液，减压回收乙醇，残留液加入蒸馏水超声溶解，过滤，稀释至950mL，得到上样液。

1.3.3 大孔树脂静态吸附与解吸附

称取6种处理干净的大孔吸附树脂各1g（以滤纸吸干水分后晾干），放入100mL的具塞的锥形瓶中，加入50mL上样液后放入25℃的水浴振荡器中以110r/min转速振摇，每间隔1h取上清液一次，測其吸光度值并计算其静态吸附量。

将吸附了色素的树脂过滤，分别用5mL蒸馏水洗去树脂表面的残留液。再将吸附色素的树脂放入具塞锥形瓶中，加入20mL 95%vol乙醇在振荡器上振摇洗脱2h，取洗脱液測定其吸光度值，计算解吸附量和解吸附率。色素在树脂上的静态吸附量及解吸附率按式（1）及（2）计算。

式中：C解吸液为解吸液中色素的质量浓度，mg/mL；V解吸液为解吸溶液的体积，mL；Q吸附为平衡吸附量，mg/g。

式中：Q吸附为平衡吸附量，mg/g；V上样液为上样液的体积，mL；C原上样液为上样液色素的起始质量浓度，mg/mL；C吸附后溶液为色素吸附平衡起始质量浓度，mg/mL；m树脂为树脂的质量，g。

1.3.4 树脂动态吸附与洗脱

将处理好的吸附树脂11.6g（以滤纸吸干水分后晾干，柱床体积约20mL）装入一支50mL的酸式滴定管内，以1BV/h的速度上样，测定流出液的吸光度，直至吸附饱和。然后，以2BV的蒸馏水洗涤树脂床，再分别以体积分数为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，以每15min接10mL洗脱液为一管。按式（3）计算树脂的动态饱和吸附量（mg/g）。

式中：Q饱和吸附量为树脂的色素饱和吸附量，mg/g；C上样液为上样液色素的起始质量浓度，mg/mL；V上样液为上样液的体积，mL；C流出液为流出液色素的质量浓度，mg/mL；V流出液为流出液的体积，mL；m树脂为树脂的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

原花青素的含量一般采用盐酸-香草醛比色法测定[12]。首先将原花青素溶液显色后用紫外光谱仪在波长190nm～600nm范围内扫描以确定最大吸收波长，得到最大吸收波长为494nm，结果与文献一致[13]。然后，按实验方法测定系列标准溶液的吸光度值，以吸光度值（Y）对浓度（x）绘制标准曲线，结果见图1。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of procyanidins

图1结果表明，原花青素在0.1926g/L～0.7062g/L范围内具有良好的线性关系，Y=-0.02855+1.1628x，相关系数R=0.9991（n=5）。

2.2 大孔树脂静态吸附与解吸附

为了考察大孔树脂对樟树果肉中紫色素的吸附效果，首先对6种树脂进行了静态吸附与解吸附试验筛选。6种树脂分别与一定浓度的樟树果肉紫色素提取液混合振摇，每间隔1h取上清液在波长494nm处测定其吸光度值，共吸附5h，静态吸附后上清液吸光度值变化的结果见图2。

由图2可知，实验中所用的6种树脂在吸附时间3h后上清液吸光度值下降变慢，即说明6种树脂已将趋于吸附饱和。其中HPD300、HPD100、HPD750三种树脂的上清液吸光度值最低，即HPD300、HPD100、HPD750树脂对樟树果肉中紫色素具有较好的吸附作用。计算结果表明，树脂HPD100、HPD300、HPD750在静态吸附5h后的饱和吸附量分别为48.46mg/g、53.85mg/g、47.56mg/g。

图2 6种大孔树脂对樟树果肉紫色素的静态吸附曲线Fig.2 Static adsorption curve of procyanidins on six different resins

吸附在树脂上的紫色素需要容易洗脱下来，才具有实际应用价值。对6种吸附了紫色素的树脂用体积分数95%乙醇进行静态解吸附实验，取上清液测定洗脱溶液的吸光度值以评价其解吸附效果。结果表明，紫色素在3种树脂HPD100、HPD300、HPD750上的的洗脱量分别为39.01mg/g、43.71mg/g、37.33mg/g，即解吸附率分别为80.50%、81.17%、78.48%。

由图2可以看出，树脂HPD300对樟树果肉紫色素的静态吸附量及解吸附率均较好，因此选用HPD300进行樟树果肉中原花青素的动态吸附研究。

2.3 大孔树脂HPD300动态吸附曲线

以树脂HPD300装入一支体积为50mL的酸式滴定管中，控制上样液流速为1BV/h，每0.5BV（10mL）接收1管，测定流出液吸光度值，绘制其动态吸附曲线见图3。

图3 紫色素在HPD300树脂上的动态吸附曲线Fig.3 Dynamic adsorption curve of procyanidins on resin HPD300

由图3可知，随着上样量的增大，流出液中紫色素含量逐渐增加，当上样体积超过1500mL，HPD300树脂对樟树果色素的吸附量迅速降低；当上样体积达到3200mL，流出液中樟树果色素的含量与上样液中含量基本相同，此时HPD300树脂吸附樟树果肉紫色素达到饱和。通过计算，HPD300树脂对樟树果肉紫色素的动态饱和吸附量达到66.34mg/g。

2.4 大孔树脂HPD300乙醇梯度动态洗脱

上述饱和吸附紫色素的HPD300树脂用蒸馏水洗涤除去表面的残留上样液后，以乙醇梯度洗脱，每个梯度的乙醇用量以洗至流出液色淡为止，洗脱液按0.5BV（10mL）接收1管，以乙醇适当稀释后测定其吸光度。为了直观对比不同体积分数的乙醇对紫色素的洗脱效果，将其所测定的吸光度值乘以稀释倍数后进行比较，结果见图4。

图4 乙醇梯度洗脱曲线Fig.4 Elution curve by different concentration of ethanol

由图4可知，吸附在树脂上的紫色素主要由3BV左右的体积分数30%的乙醇洗脱下来。

为了进一步比较不同浓度的乙醇对吸附在HPD300树脂上的紫色素的洗脱效果以及紫色素的纯化效果，将各浓度乙醇梯度洗脱的溶液合并回收溶剂，得到粉末状样品，各样品的质量及样品中原花青色素的含量（以葡萄皮原花青素为对照样品进行测定）见表1。

表1 HPD300分离樟树果肉紫色素的结果Table 1 Results of separation of proanthocyanidins by macroporous resin HPD300

由表1可知，吸附在树脂上的物质主要由体积分数为30%、50%的乙醇洗脱下来。上样后HPD300树脂吸附色素的总量为771.96mg，洗脱总量为755.60mg，总洗脱率97.88%，其中体积分数30%的乙醇洗脱率为66.43%，洗脱物中原花青素的含量达到97.54%（以葡萄皮中原花青素计），为上样液中原花青素含量（5.77%）的16.8倍。

原花青素通常以酸性水溶液或酸性醇溶液提取[14-16]，提取液调节pH值后以大孔树脂吸附，再在酸性条件下进行上样吸附和洗脱进而达到纯化目的[17-18]。酸水提取虽然提取效率高，但也存在环境污染、影响产品的“纯天然性”等问题，而且酸性溶液一般还会影响原花青素在大孔树脂上的吸附效果。桂克印等[11]用酸性水提取樟树果肉的原花青素，以大孔树脂D406吸附pH=3的上样溶液、再以pH=6的体积分数50%的乙醇洗脱达到纯化色素的目的，结果色素的纯化倍数为4.8倍。本实验在室温下以乙醇为溶剂、超声辅助提取樟树果肉的原花青素，提取液经减压回收乙醇后加适量水稀释后制成原上样液；然后以大孔吸附树脂HPD300上样吸附，以乙醇梯度洗脱色素。结果表明，樟树果肉的原花青素在大孔树脂HPD300上的吸附量大，色素主要由体积分数30%的乙醇洗脱下来，纯化后样品不仅原花青素的含量高，而且为天然的紫色；树脂床经体积分数70%的乙醇洗脱后回归为树脂的原有白色，可直接循环使用。

3 结论

本实验首先以静态筛选方法，从6种大孔树脂中筛选出对樟树果肉紫色素吸附与洗脱效果较好的HPD300树脂，然后对其进行了树脂动态吸附与乙醇梯度洗脱的实验。结果表明，树脂HPD300对樟树果肉紫色素的动态饱和吸附量为66.34mg/g树脂，紫色素主要由体积分数30%的乙醇洗脱洗脱下来，洗脱率为66.43%，洗脱物中原花青素的含量可达到97.54%。树脂床经体积分数70%的乙醇洗脱即可再生，总洗脱率达到97.88%。该方法显示樟树果肉紫色素在大孔树脂HPD300上的吸附量大、样品中原花青素含量高、产品纯天然等特点，为樟树果中紫色素的开发利用提供了参考。

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