梁 杏，赵声兰*，曹冠华，蔡雪梅，程祥云，和小明，陈朝银

（1.云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500；昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

核桃又名胡桃、羌桃、万岁子，系胡桃科核桃属植物，具有补气养血、温肠补肾、润肺止咳、乌发健脑等作用。核桃仁含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素E和微量元素等[1-3]。核桃仁螺旋压榨制油后的饼粕含有丰富的蛋白质，是蛋白肽的良好原料，但目前多用于饲料和肥料。近年来的研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收[4]，某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时具有防病治病、调节人体机能等多种生理功能[5-7]，有些没有生物活性的蛋白质水解为多肽后会具有活性，成为生物活性肽[8]。核桃蛋白肽具有溶解度高，受pH值影响小，同时具备高浓度、低黏度等特点，与核桃蛋白相比，核桃多肽的乳化性、起泡性、吸油性等方面都更加优良，此外核桃多肽还具有较强的抗氧化能力及对超氧阴离子有一定清除作用[9-12]等。本研究采用液态发酵法，通过枯草芽孢杆菌的生长繁殖和代谢反应，将核桃饼粕中的核桃蛋白转化成为核桃多肽，为核桃饼粕的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃饼粕：云南汇智源食品有限公司；蛋白质含量43.23%，粗脂肪9.90%，粗灰分3.62%，总糖7.56%，水分4.62%[13]。

菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis natto）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）购自云南省微生物研究所菌种保藏中心。

没食子酸、钨酸钠、钼酸钠等化学试剂均为国产分析纯。

福林酚试剂：称取20g钨酸钠和5.0g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140mL蒸馏水溶解，加入10mL 85%浓磷酸及20mL浓盐酸，充分混匀，小火回流10h，稍冷后加入3g硫酸锂及15mL双氧水，加热沸腾（开口）至亮黄色，不带绿色为止，冷却，移至250mL容量瓶中，蒸馏水定容，装入棕色瓶，于4℃条件下保存。10%福林酚试剂：取20mL福林酚试剂加水定容至200mL，现配现用。

没食子酸对照品储备液配制（100μg/mL）：取0.0050g没食子酸对照品，蒸馏水溶解，定容至50mL。没食子酸对照品工作液：用移液管分别移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的没食子酸对照品储备液于10mL容量瓶中，分别用蒸馏水定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的没食子酸工作液。

营养琼脂培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L。

发酵培养基：牛肉膏 2g/L，蛋白胨 3g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸钠3g/L，磷酸氢二钾10g/L，氯化钙3g/L。

1.2 仪器与设备

雷磁pHS-3C型pH计：上海精密科学仪器有限公司；KDY-12型消化炉、QSY II型凯氏定氮仪：北京强盛分析仪器制造中心；L-550型低速台式离心机、TG16-WS高速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器系统有限公司；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZHWY111B恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；UV759S型紫外-可见分光光度计：上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含量测定

多酚含量的测定采用福林酚比色法[14-16]。蛋白质含量的测定按照GB/T5009.5—2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。游离氨基酸含量的测定采用甲醛滴定法。酸溶蛋白氮含量的测定：发酵液8500r/min离心10min，取上清液10mL，加入10%三氯乙酸溶液10mL，混合均匀，静置3min，9500r/min离心5min，取10mL上清液测定酸溶蛋白氮的含量。多肽含量计算公式：

1.3.2 发酵培养

取14个500mL三角瓶，分别准确加入10g核桃饼粕，20g/L葡萄糖溶液20mL，75mL的生理盐水，121℃、21min灭菌，其中7瓶接种扩大培养好的菌种，剩下7瓶作空白对照，37℃、180r/min摇床培养7d，每天取一瓶样品和一瓶空白对照测氨基酸含量和酸溶性蛋白含量。

1.3.3 适宜菌种的选择

测定水解圈直径，由于测量水解圈直径通常包含菌落直径，为便于客观比较，采用了水解圈直径与菌落直径比值，该比值越大，说明该细菌所产蛋白酶的活性越高。

1.3.4 菌种液制备

发酵培养基中分别各接5环枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌，37℃、180r/min摇床培养24h制备各实验用菌液。

1.3.5 核桃饼粕多酚粗提物的制备

核桃饼粕用5倍量65%vol乙醇95℃回流提取1h，滤液真空旋转蒸发浓缩、冷冻干燥即为核桃饼粕多酚粗提物。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选

在用琼脂2.0g、水100mL、脱脂奶粉3g制备的培养基（pH值7.0～7.2）中挖3个小孔，3个小孔中分别加入8μL枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌的菌液，37℃恒温培养24h后观察菌落水解圈，测定水解圈直径与菌落直径的比值，结果纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌未见明显的水解圈，枯草芽孢杆菌有明显的水解圈，其水解圈直径与菌落直径的比值为1.58，故选择枯草芽孢杆菌进行接种液态发酵。

2.2 多酚对枯草芽孢杆菌菌落生长和分解蛋白质的影响

以脱脂奶粉3g、琼脂2g、蒸馏水100mL制备培养基（pH值7.0～7.2），灭菌后倒入培养皿，分别将浓度为0.2%、0.5%、3.0%的核桃皮多酚粗提物2mL加入培养基表面，用三角棒平铺均匀，待表面较干燥后接种枯草芽孢杆菌，同时做不加核桃多酚粗提物仅接种枯草芽孢杆菌的对照组和不加核桃皮多酚粗提物、不接种枯草芽孢杆菌的空白组，每组做二组平行实验，37℃恒温培养36h～72h，观察枯草芽孢杆菌生长和对蛋白质的水解，结果分别见表1和表2。

表1 枯草芽孢杆菌的菌落直径Table 1 Colony diameter ofB.subtilis

由表1、表2可知，随着核桃多酚粗提物浓度的增加，枯草芽孢杆菌菌落生长受到的抑制作用增加，水解圈直径与菌落直径比值变小，当核桃多酚粗提物浓度达3.0%时，已经观察不到水解圈。核桃多酚粗提物会抑制枯草芽孢杆菌生长繁殖及其对蛋白质的水解，故利用枯草芽孢杆菌发酵核桃饼粕之前，应提取核桃饼粕中的多酚物质的，以利于发酵。

2.3 核桃饼粕中多酚类物质的提取

表2 水解圈直径与菌落直径比值Table 2 Ratio of hydrolysis circle diameter and colony diameter

2.3.1 没食子酸标准曲线的制备

分别精密吸取没食子酸工作液1mL于10mL容量瓶中，加入5.0mL 10%福林酚试剂，摇匀，5min后加入7.5%碳酸钠溶液4.0mL（前后时间间隔不超过8min），混匀，加水定容，30℃避光放置反应1h，在波长765nm处测定其吸光度值。吸光度值（y）与没食子酸浓度（x，μg/mL）的回归方程y=0.0128x+0.0123，r=0.9991，没食子酸在0μg/mL～50μg/mL范围内，浓度与吸光度值呈良好线性关系。

2.3.2 提取工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，参考相关文献[17]，采用L9（34）正交试验研究提取时间、温度和乙醇浓度对核桃饼粕中多酚类物质提取的影响。试验因素水平见表3，每组做3次重复试验，正交试验结果与分析见表4，方差分析见表5。

表3 提取工艺优化正交试验因素与水平Table 3 Factors and levels of orthogonal test for extraction technology optimization

由表4可知，提取时间、温度、乙醇浓度对多酚提取影响由大到小顺序是C＞B＞A，即乙醇浓度＞温度＞时间，适宜的提取条件为A3B3C1，即提取时间60min、提取温度95℃、乙醇浓度65%vol。在此最佳条件下进行验证试验，多酚含量为7.22%。由表5可知，乙醇浓度对多酚含量影响显著，其余2个因素对多酚含量影响不显著。

2.4 枯草芽孢杆菌液态发酵核桃饼粕

2.4.1 枯草芽孢杆菌对核桃饼粕的液态发酵

将枯草芽孢杆菌按菌液：发酵培养基为3∶100的量接种核桃饼粕液体发酵培养基进行液态发酵，同时进行不接种枯草芽孢杆菌的空白试验，每天取样分析测定样品组和空白组中的游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量，结果见图1。由图1可知，发酵0h～24h，游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量随发酵时间的增加而增加，发酵24h～48h，游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量有所下降，发酵48h～96h，游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量随发酵时间的增加而增加，发酵96h～168h，酸溶性蛋白质和多肽含量趋于平稳。枯草芽孢杆菌液态发酵核桃饼粕，可较好地使其蛋白转化为游离氨基酸和多肽，发酵时间以酸溶蛋白达最高时的拐点（96h）为宜。

表4 提取工艺优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for extraction technology optimization

表5 正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results

图1 游离氨基酸和酸溶性蛋白质含量的变化Fig.1 Variation of free amino acid and soluble protein content

2.4.2 核桃饼粕多酚对发酵的影响

图2 核桃饼粕多酚对发酵中游离氨基酸含量的影响Fig.2 Effect of walnut residue polyphenols on free amino acid content during fermentation

图3 核桃饼粕多酚对发酵中酸溶性蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of walnut residue polyphenols on acid soluble protein content during fermentation

图4 核桃饼粕多酚对发酵中多肽含量的影响Fig.4 Effect of walnut residue polyphenols on the content of polypeptide during fermentation

用枯草芽孢杆菌扩大培养分别对除去和不除去多酚类物质的核桃饼粕进行液态发酵，每4h取样测定游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量，同时进行不加枯草芽孢杆菌的样品对照试验，结果（图2～图4）可知，核桃饼粕中的多酚对枯草芽孢杆菌液态发酵有一定影响，将核桃饼粕中的多酚提取除去后再进行发酵，有利于发酵，去除多酚的样品发酵液中的游离氨基酸、酸溶性蛋白质和多肽含量均高于不去除多酚的样品20%以上，而且去除多酚后进行发酵，酸溶蛋白达最高点的发酵时间可缩短25%以上。

3 结论

相比纳豆枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌具有较强水解核桃饼粕蛋白的能力，是液态发酵核桃饼粕的适宜菌种，发酵时间以96h为宜。核桃饼粕中的多酚类物质会抑制枯草芽孢杆菌发酵核桃饼粕，且随着多酚类物质浓度的增大，抑制作用增强，除去核桃饼粕中多酚类物质，可提高发酵液中的游离氨基酸和多肽含量20%以上，缩短发酵周期25%以上。核桃饼粕中多酚类物质适宜的提取条件为65%vol乙醇，提取温度95℃，提取时间1h。

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