王继胜，丁 见，吴 锋，熊克仁

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

眼镜蛇毒液成分复杂，中毒后会出现剧烈疼痛、肢体瘫痪、凝血功能障碍和多器官功能衰竭等表现，现在仍是世界性治疗难题［1］。我室曾报道眼镜蛇毒对脊髓造成损伤后，会影响神经递质和细胞因子如乙酰胆碱酯酶、c-fos等在脊髓灰质的表达［2－3］。中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是机体运动和感觉的初级中枢，对机体生命活动有重要意义。有研究表明，脊髓损伤时，巢蛋白(Nestin)和脑源性神经营养因子(brain-derived neorotrophin factors，BDNF)表达增加，可促进内源性神经干细胞(neural stem cells，NSCs)分化为成熟的神经元或(和)神经胶质细胞，参与脊髓损伤的代偿性修复［4－5］。尚未见眼镜蛇毒致脊髓损伤后Nestin和BDNF表达的报道，值得研究。本实验通过免疫组织化学的方法观察眼镜蛇毒对脊髓腰段Nestin和BDNF表达的影响，为眼镜蛇毒致伤后的治疗提供一些动物实验研究的形态学资料。

1 材料与方法

1．1 蛇毒 眼镜蛇毒(干毒)，由安徽省黄山市屯溪毒蛇养殖研究所提供。

1．2 实验动物及分组 实验用SD大鼠24只(由皖南医学院实验动物中心提供)，雌雄不拘，体质量(250±20)g。随机分成3组，即正常对照组、生理盐水组和眼镜蛇毒组，每组8只。

1．3 实验方法 眼镜蛇毒组，于大鼠左大腿常规消毒后，将干粉状眼镜蛇毒与生理盐水按1∶3稀释，按0．5μl/kg量注入左大腿后内侧;生理盐水组在相同部位注入等量生理盐水。正常对照组不作任何处理。观察30 min，眼镜蛇毒组大鼠烦躁不安，毛发竖立，呼吸急促伴湿啰音等中毒症状明显时，30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注;同时，也将生理盐水组和正常对照组大鼠处死。取L4～6脊髓，石蜡包埋，切片，片厚5 μm，切片常规脱蜡，依次入下列各步骤:3%H2O2，室温10 min，正常小牛血清室温下封闭60 min不洗，滴加一抗Nestin(1∶150)、BDNF(1∶150)，4°C 下 18 h，生物素化羊抗兔IgG(1∶100)室温60 min，链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC 1∶100)液60 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，以上各步间均用0．02 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7．2～7．6)充分清洗(5 min×3次)。常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜观察。

1．4 神经元计数及图像处理 每组选取相同冠状切面的切片各24张(每只大鼠3张)，在高倍视野(×400)下计数脊髓前角和后角典型的Nestin和BDNF阳性神经元的数量，并用病理图像分析系统测量单位面积(50μm×50μm)平均灰度值。

1．5统 计分析结果以均数±标准差(¯x±s)表示，用SPSS18．0统计软件进行统计分析，多组间采用F检验，组间两两比较采用q检验，检验水准α=0．05，以P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠脊髓Nestin的表达 正常对照组、生理盐水组和眼镜蛇毒组脊髓前角和后角均可见Nestin阳性神经元。正常对照组、生理盐水组Nestin阳性神经元数量较少，着色较浅，突起清晰可见;眼镜蛇毒组Nestin阳性神经元数量较多，着色较深，突起不清晰(图1、2)。脊髓Nestin免疫反应阳性产物主要表达于细胞胞浆及胞膜，呈棕黄色。与正常对照组比较，生理盐水组Nestin阳性神经元数量及平均灰度值差异均无统计学意义(P＞0．05);眼镜蛇毒组脊髓Nestin阳性神经元数量较正常对照组和生理盐水组明显增多(P＜0．01)，平均灰度值明显降低(P ＜0．01，表 1)。

表1 各组大鼠脊髓Nestin阳性细胞数量及平均灰度值(¯x±s，n=8)Tab 1 The number of nestin positive cells and average gray value in the spinal cord of each group of rats(¯x±s，n=8)

2．2 各组大鼠脊髓BDNF的表达 正常对照组、生理盐水组和眼镜蛇毒组脊髓前角和后角均可见BDNF阳性神经元，脊髓BDNF免疫反应阳性产物主要表达于细胞胞浆及胞膜，呈棕黄色。正常对照组、生理盐水组BDNF阳性神经元数量较少，着色较浅，突起清晰可见;眼镜蛇毒组BDNF阳性神经元数量较多，着色较深，突起不清晰(图3、4)。与正常对照组比较，生理盐水组BDNF阳性神经元数量及平均灰度值差异均无统计学意义(P＞0．05);眼镜蛇毒组脊髓BDNF阳性神经元数量较正常对照组和生理盐水组明显增多(P＜0．01)，平均灰度值显著降低(P＜0．01，表2)。

表2 各组大鼠脊髓BDNF阳性细胞数量及平均灰度值(¯x±s，n=8)Tab 2 The number of BDNF positive cells and average gray value in the spinal cord of each group of rats(¯x±s，n=8)

图1 大鼠脊髓前角Nestin的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig 1 Nestin expression in anterior horn of spinal cord of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:Normal control group;B:Normal saline group;C:naja naja atra venom treated group

图2 大鼠脊髓后角Nestin的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig．2 Nestin expression in the dorsal horn of spinal cord of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:Normal control group;B:Normal saline group;C:naja naja atra venom treated group

图3 大鼠脊髓前角BDNF的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig 3 BDNF expression in the anterior horn of spinal cord of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:Normal control group;B:Normal saline group;C:naja naja atra venom treated group

图4 大鼠脊髓后角BDNF的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig．4 BDNF expression in the dorsal horn of spinal cord of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:Normal control group;B:Normal saline group;C:naja naja atra venom treated group

3 讨论

眼镜蛇毒主要成分是神经毒素，可使脊髓灰质前角和后角 c-fos的表达均增加，对脊髓造成损伤［3］。本实验结果显示眼镜蛇毒致伤后脊髓腰段灰质前角和后角Nestin、BDNF的表达均显著增加。脊髓灰质前角运动神经元参与构成中枢神经系统下行传导通路，对肢体运动、调节肌张力等有重要作用;脊髓灰质后角是躯体伤害性刺激传递的前站和对伤害性信息处理的重要部位，是解释伤害性信息在中枢内传递和调控的关键［6］。

Nestin是NSCs的特异性标志物，也是中枢神经系统早期损害的标志物之一，参与NSCs的生存和自我更新［7－8］。NSCs可分化为成熟的神经元或(和)神经胶质细胞对脊髓损伤具有修复作用［9］。一般在生理情况下，Nestin在中枢神经系统中表达较低，本实验结果显示，眼镜蛇毒可使脊髓灰质前角和后角Nestin的表达显著增加，提示脊髓对眼镜蛇毒的损伤可能具有一定的自我修复能力。有研究表明，在脑损伤时梗死灶周边区域的Nestin免疫阳性细胞也可见BDNF的表达，BDNF能调控神经元再生所需的微环境，并能减少它受损及凋亡［10－11］。

BDNF是一种小分子二聚体蛋白质，BDNF主要由神经元和胶质细胞合成，2003年Lu等［12］首次证明体外培养的NSCs能持续分泌BDNF。BDNF能起到神经保护作用，促进神经元轴突的修复及神经趋向性作用，当BDNF作用于未分化的NSCs，使之增殖、分化，形成正反馈环路促进NSCs的分化并支持神经元的存活，BDNF与中枢神经系统内痛觉的传导也密切相关［13－15］。以往的研究认为，在中枢神经系统内，Nestin主要在胚胎期和成年的NSCs中一过性表达，但Gage等［16］证实，成年哺乳动物(包括人)的中枢神经系统中存在NSCs，只是绝大多数处于静止状态。本实验结果表明，眼镜蛇毒对脊髓致伤后使脊髓灰质BDNF的表达显著增加，提示BDNF可能参与脊髓在眼镜蛇毒致伤后的自我修复，其机制可能为眼镜蛇毒对脊髓致伤后，处于静止状态的NSCs被激活，在神经元和神经胶质细胞等分泌的BDNF作用下，NSCs分化为成熟的神经元或(和)神经胶质细胞，与尚存的神经元重新构建功能联系，从而参与脊髓运动和感觉功能的代偿性修复。本实验结果为眼镜蛇毒致伤的治疗提供一定的动物实验研究的形态学资料，也为临床上对于眼镜蛇毒致伤后某些运动和感觉功能的恢复性治疗时考虑运用增加BDNF的治疗手段来促进NSCs的增殖、分化，以有利于患者的神经功能恢复。

本实验结果还观察到，正常对照组和生理盐水组脊髓前角运动神经元突起清晰可见，而眼镜蛇毒组运动神经元突起不清晰，提示眼镜蛇毒可能对运动神经元突起有破坏作用，从而导致机体运动功能障碍。笔者推测这种损伤可能是因在大鼠大腿部肌肉注射的眼睛蛇毒中的神经毒素沿坐骨神经到达脊髓腰段运动神经元所造成，具体机制需要以后进一步设计利用辣根过氧化物酶标记物进行逆行性追踪研究来证实。

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