王晓伟 张子平 王艺磊 贾锡伟 林鹏

虾蟹类是重要的水产养殖和捕捞对象，具有很高的经济价值。虾蟹生殖生物学研究对其养殖产业的发展非常重要，通过调控虾蟹内分泌系统提高生殖发育速度、缩短成熟时间，将可促进虾蟹养殖产量的提高。去除眼柄（eyestalk ablation，ESA）是刺激虾蟹类性腺成熟和排卵的常用方法，普遍认为这是因为去除了眼柄中的性腺抑制激素（gonad inhibitinghormones，GIH），但ESA会导致卵子质量下降，孵化率降低等。在过去的30年，一些尝试通过调控内分泌系统而非ESA的方式来诱导生殖。如使用GIH抗体、神经递质进行调控；通过双链RNA干扰（dsRNAi）降低GIH转录；通过温度、盐度、光周期等环境因子改变激素水平等［1］进而调控生殖细胞的形成和卵黄蛋白的合成等。

1 CHH家族在生殖中的作用

CHH家族是窦腺（sinus gland，SG）中最丰富的一类肽激素［2］。该家族包括甲壳动物高血糖激素（crustaceanhyperglycemichormone，CHH）、蜕皮抑制 激 素（molt-inhibitinghormone，MIH）、 性 腺 抑制激素（vitellogenesis/gonad-inhibitinghormone，VIH/GIH）、大颚器官（mandibular organ，MO）抑制激素（MOIH）。这些CHH家族神经肽根据成熟肽及其前体的初级结构可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种，Ⅰ型神经肽前体由信号肽序列、CHH前体相关序列、碱性氨基酸加工位点和成熟肽部分组成，成熟肽一般由72-73个氨基酸残基组成；Ⅱ型神经肽只有信号肽和成熟肽序列两部分组成，其成熟肽部分由74-83个氨基酸残基组成［3］。这些激素成熟肽的分子量约为7-9kD，氨基酸序列相似，均有6个保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键［4］。两种类型神经肽的最大区别在于Ⅱ型神经肽的成熟肽部分第12个氨基酸为甘氨酸［3］。研究表明，VIH/GIH抑制性腺的发育在调控虾蟹类甲壳动物性腺发育过程中起关键作用；CHH、MIH和MOIH在性腺发育中的作用也越来越受到重视。

1.1 VIH

VIH抑制虾蟹类卵巢发育。在锯齿长臂虾（Palaemon serratus）中去除眼柄会引起卵黄物质提前积累和卵巢体积快速增加。Pervaiz 等［5］，Alikunhi［6］和Arnstein［7］分别在对沼虾属Macrobrachium dayanum、斑节对虾（Penaeusmonodon）和中国对虾（Penaeus orientalis）的去除眼柄的研究中也得到类似结果，这显然是由于去除眼柄后解除了GIH/VIH对性腺发育的抑制。一些研究进一步报道在虾蟹中GIH的靶器官是卵巢和肝胰腺［8］。与成熟斑节对虾VIH序列相关的dsRNA能够使体外培养的斑节对虾眼柄神经节、腹神经索和斑节对虾亲体的VIH转录水平降低；敲除斑节对虾的VIH其卵巢的卵黄蛋白原（vitellogenin，Vtg）转录水平显著上升，说明了VIH对Vtg基因表达有抑制作用［8］。最新的研究表明，MEK1/2抑制剂U0126可以诱导斑节对虾卵巢成熟，且推测ERK1/2抑制眼柄XO-SG中VIH的表达［9］。Rotllant等［10］用免疫组织化学和原位杂交的方法对欧洲龙虾（Homarus gammarus）幼体和成体中VIH的比较研究发现，幼体中VIH的浓度远高于成体，这说明幼体期VIH高表达抑制卵巢的发育有利于机体的生长，成体VIH低表达有利于卵巢的发育，在发育期之前VIH可能对性腺发育有抑制作用。De Kleijn等［11］研究了美洲龙虾（Homarus americanus）VIH在生殖周期过程中的表达、储藏和释放机制发现，VIH在X器官表达，Ⅰ型VIH在窦陷中出现，且只在未成熟期表达。与此相反，VIH在未成熟和卵黄发生前期的血淋巴均有高水平表达。由此推测，VIH可能抑制卵巢中卵黄生成的启动。Wongsawang等［12］报道眼柄提取物含有性腺抑制激素和刺激性腺的多肽，如VIH和GSH（gonad stimulatehormone，GSH）。当VIH和蜕皮类固醇浓度低，性腺刺激因子（gonad stimulate factor，GSF）和甲基法尼酯（methyl farnesoate，MF）浓度高时，可以启动甲壳动物的生殖［13，14］。这些研究结果均表明眼柄神经肽VIH抑制性腺发育。

1.2 MIH

MIH的主要功能是抑制Y器官合成蜕皮激素，延长蜕皮周期，而在虾蟹类中关于MIH调控生殖的报道较少［15］。目前，已经在黄道蟹（Cancer pagurus）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）、红鳌螯虾（Cherax quadricarinatus）、刀额新对虾（Metapenaeus ensis）等中获得了MIH全长序列。已有证据表明MIH促进性腺的发育。如Tiu等［16］对雌性刀额新对虾注射重组MIH蛋白后发现，肝胰腺中卵黄蛋白原基因的表达水平上升，并且相应的在这些雌虾的血淋巴和卵巢中检测到具有类似卵黄蛋白原免疫原性的蛋白；而在注射MIH-B dsRNA后，这些雌虾胸神经节和卵巢中MIH水平下降，同时肝胰腺和卵巢中卵黄蛋白原表达量下降。在刀额新对虾中MIH的mRNA转录水平在卵黄发生前期低下，在到成熟晚期的过程中表达量不断上升［17］。MIH与特异的受体结合后，可能以cAMP为第二信使将细胞外信号传递到细胞内［18］。此外，MIH在肝胰腺上结合位点的数量随卵巢发育发生变化，Ⅲ期比Ⅰ期和Ⅱ期高2倍［18］。这些结果表明MIH是甲壳动物蜕皮和繁殖的关键调节因子，它可以同时参与抑制蜕皮和诱导卵巢成熟。

1.3 MOIH

MOIH是由XO-SG复合体分泌的神经肽，能够间接的抑制卵黄的发生。MOIH抑制甲壳动物大颚器分泌MF，而MF促进动物卵黄发生，是一种重要的甲壳动物的性腺刺激激素。因此，MOIH通过抑制大额器官MF的分泌而间接抑制卵黄发生。有一些研究结果支持这一观点，Borst等［19］发现利用反向高效液相色谱法（reversed-phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）从黄道蟹眼柄SG提取物中分离到MOIH-1和MOIH-2，且证明它们直接作用于MO，抑制MF的生物合成，降低法尼酸甲基转移酶（farnesoic acid O-methyl transferase，FAO-MeT）活性；Nagaraju等［20］在淡水蟹Oziotelphusa senex senex中鉴定出两种具有MOIH活性的多肽，具有抑制MO合成MF的活性。Borst等［19］研究黄道蟹的得出同样的结论。他们研究多种影响信号通路的物质发现，cAMP在MOIH抑制MF合成的信号传导过程中起重要作用。为进一步阐明MOIH对性腺发育的调控机制，许多学者对MF的功能也作了大量研究。MF是昆虫类保幼激素Ⅲ前体类似物，已证实它与后者有类似功能。对普通滨蟹（Carcinusmaenas）和蜘蛛蟹（Libinia emarginata）大颚器官的组织学研究表明，其在卵巢成熟时有更高的活性。离体试验证明MF与普通滨蟹、蜘蛛蟹及大西洋砂招潮蟹（Uca pugilator）的卵巢发育有关。克氏原螯虾（Procambarus clarkii）和淡水蟹O.senex senex中大颚器合成MF的速率随性腺发育而发生显著变化［21］。在一些甲壳动物中注射MF可以提高血淋巴中Vtg的浓度，刺激卵巢成熟发育［14，22-24］。体外研究显示MF刺激卵母细胞增长，提高肝胰腺与卵巢Vtg的mRNA水平。这些结果表明MOIH抑制MO合成MF，MF直接作用于肝胰腺和卵巢，从而调控性腺的发育（图1）。

图1 虾蟹卵巢发育调控模式图

1.4 CHH

在普通滨蟹和利莫斯螯虾（Orconectes limosus）中的受体结合试验表明，CHH可能有不同的靶标，并且有可能促进生殖。在蓝蟹（Callinectes sapidus）卵巢发育早期CHH能刺激卵黄发生［25］。De Kleijn等［8］研究美洲海螯虾（Amrica langostino）CHH在生殖周期的表达发现，CHH-A在卵黄生成前有高表达，CHH-B随性腺卵巢的成熟表达量不断增加，CHH总量（CHH-A和CHH-B）在成熟的过程中有明显升高。由此认为CHH-A和CHH-B有参与启动卵黄生成作用，CHH-B负责刺激卵母细胞成熟。Webster［26］报道在包括三叶真蟹（Carcinusmaenus）卵母细胞膜在内的多种组织中有CHH受体存在，说明CHH在这些组织中可能具有不同的功能。

2 GSFs在虾蟹类生殖中的作用

目前对GSF的研究还较少，ESA的效应与胸神经节或脑的移植试验表明存在GSFs，但这些物质是不是多肽尚不清楚，需要对GSFs的特性进一步研究。匙指虾科的Paratya compressa和哈氏仿对虾（Parapenaeopsishardwickii）的脑和胸神经节提取物在体内和体外都可以促进卵巢的生长，但是在P.compressa中脑的提取物比胸神经节更有效。脑和胸神经节提取物可以诱导P.compressa卵巢的成熟和次级卵母细胞的发育。在大西洋砂招潮蟹中，GSF随着每年的生殖周期而变化。Yano等［27］报道美洲龙虾的胸神经节移植入无生殖能力的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）可引起卵巢的成熟。注射脑和胸神经节提取物及在体外的孵育试验表明胸神经节提取物能够促进卵黄生成，这些结果说明GSF的作用可能没有物种特异性。

3 类固醇激素在虾蟹类甲壳动物生殖中的作用

3.1 蜕皮激素

蜕皮激素的功能除参与蜕皮外，在调节虾蟹类卵黄生成、卵巢成熟和蛋白合成中也起着重要作用［12，28，29］。已发现蜕皮激素在长缝拟对虾（Parapenaeus fissures）、美洲龙虾、锯齿长臂虾、欧洲龙虾、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、蜘蛛蟹和斑节对虾卵巢及卵子中存在。Lachaise等［30］发现，在普通滨蟹卵巢发育过程中卵巢蜕皮激素水平升高。在Acanthonyx lunulatus，日本沼虾（Macrobrachium nipponense）［31］和罗氏沼虾中观察到卵黄发生与血淋巴蜕皮激素浓度的正相关关系。20-羟基蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）在体外明显刺激斑节对虾Vg1基因在卵巢和肝胰腺的表达［32］。然而，Young等发现在斑节对虾的卵黄发生过程中血淋巴蜕皮激素水平降低。锯缘青蟹（Scylla serrata）卵巢和血淋巴中的固醇类激素水平在卵黄发生初期上升［33］。为进一步了解虾蟹类的生殖调节机制，蜕皮激素在生殖方面的作用还需要进一步的研究。

3.2 脊椎动物型类固醇激素

甲壳动物性腺存在与脊椎动物相同的性类固醇激素，而且甲壳动物酶系统也具有合成脊椎动物型类固醇的能力［29，34，35］。Fairs 等［36］研究了斑节对虾卵黄发生过程中的类固醇浓度的变化发现，在卵黄生成阶段雌激素浓度高，这说明雌激素可能具有刺激卵黄发生的作用。黄体酮和雌二醇是脊椎动物型类固醇，在斑节对虾和短趾和尚蟹（Mictyris brevidactylus）中血淋巴Vtg水平与黄体酮成正相关关系。在哈氏仿对虾中注射黄体酮可以诱导卵巢的发育。与此相反，在日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）卵巢成熟与血淋巴类固醇激素水平之间存在负相关关系［31］。在锯缘青蟹卵黄发生的不同时期，卵巢和血淋巴中的黄体酮发生波动［33］。黄体酮和雌二醇明显刺激刀额新对虾的肝胰腺和卵巢组织中Vg1基因的表达［32］。向日本囊对虾注射17α-羟孕酮可促进卵巢的生长和卵黄生成作用。17β-雌二醇可以刺激Cherax albidus的卵黄生成［37］。注射 17α-羟孕酮可诱导O.senex senex［38］卵巢成熟。在脊椎动物中，类固醇激素要发挥生理作用必须与核受体相结合。

4 神经递质在生殖中的作用

神经递质在虾蟹类生殖中的作用越来越受到重视，一些虾蟹类神经递质功能的研究已取得进展。Beltz［39］发现生物氨类物质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和章鱼氨（octopamine，OA）在控制美洲海螯虾的交配行为中起关键作用（图1）。Kulkarni的研究表明5-HT刺激克氏原螯虾的卵母细胞成熟。Tinikul等［40］应用高效液相色谱结合电化学检测技术对罗氏沼虾卵巢发育各时期中枢神经系统和卵巢中5-HT和多巴胺（dopamine，DA）浓度进行测定发现，脑和胸神经节中5-HT随卵巢发育逐渐升高，且在第Ⅳ期达到最大，而脑和胸神经节中DA的浓度在卵巢发育第Ⅱ期达到最高，随后降低；且注射5-HT可使Ⅳ期的血淋巴中Vtg含量显著增加，而注射DA则效果相反。还有一些研究发现，5-HT和DA在利莫斯螯虾、克式原螯虾（Procambarus clarkii）和罗氏沼虾的中枢神经系统广泛分布且随卵巢发育各时期发生变化［41］。生物氨在一些虾蟹类动物中作为神经递质参与神经激素的释放［42］。如在招潮蟹和克式原螯虾中注射5-HT激活了胸神经节释放GSF。5-HT注射克式原螯虾促进了14C标记的亮氨酸进入卵巢蛋白。进一步研究发现DA在雌性克式原螯虾中抑制5-HT促进性腺发育的作用，而OA是否促进美洲龙虾卵巢生长取决于剂量大小。在凡纳滨对虾［43］中注射5-HT可以诱导卵巢的发育，但比单侧ESA效率低。Alfaro等［44］用5-HT和DA拮抗物螺旋哌丁苯（spiperone）处理凡纳滨对虾和南美蓝对虾（Litopenaeus stylirostris），促进了卵巢的发育和排卵。同时注射5-HT与螺旋哌丁苯和单独注射螺旋哌丁苯都能刺激罗氏沼虾卵巢成熟和胚胎发育，使卵巢指数和卵母细胞直径增加［45］。也有人报道用螺旋哌丁苯处理红螯螯虾（Aegla platensis）可以刺激卵巢的成熟并且使产卵量升高［46］。Cahansky等［46］也报道，含有螺旋哌丁苯的食物可以使魔蝎虾（Aegla platensis）的性腺指数（gonadosomatic index，GSI）升高。在卵黄发生前期注射螺旋哌丁苯引起克式原螯虾GSI增加［47］。螺旋哌丁苯也可以引起Aegla uruguayana schmitt卵巢和肝胰腺中脂质和胆固醇的增加［48］，他们发现高性腺指数伴随着卵巢和/或肝胰腺的高脂质含量，这说明生殖过程需要大量能量。也有研究显示，5-HT注射罗氏沼虾引起血淋巴中 Vg含量显著上升［49］。Meeratana等［50］关于5-HT对罗氏沼虾卵巢发育影响的研究表明，5-HT间接的诱导卵巢发育和卵母细胞成熟。可见，5-HT和DA在虾蟹类性腺发育和排卵的拮抗调控过程中起着关键的作用（图1）。

5 环境因子对生殖的影响

在生物进化的过程中，甲壳动物形成了较为完善的生殖调控系统，生殖相关激素水平会随外界环境变化作出相应改变，使甲壳动物在最佳的环境条件下生殖。环境的变化因素如盐度、光照、温度在调节甲壳动物生理（包括生殖、蜕皮、摄食、行为和形态变化等）中起重要作用［1］（图1）。Nagaraju和Borst［24］在11℃和18℃时将普通滨蟹转移到稀释的海水，MF上升了近100％。已有与其结果一致的报道。随着水的盐度稀释到5 ppt，青蟹血淋巴中MF水平比海水等渗溶液中的青蟹增加5-10倍［51］。高温（32℃）、缺氧（0.25 ppm O2）和降低盐度都可以引起普通滨蟹［52］血淋巴中MF的显著上升。而将广盐性的蓝蟹暴露在低盐度（15 ppt）的海水中，血淋巴MF的水平不会上升［53］；在11℃时用低盐度的水处理的普通滨蟹也观察到类似的结果［24］。Akta等［54］分别研究了在桃红对虾（Penaeus duorarum）和短沟对虾的温度变化对卵巢发育和排卵的影响发现，水温在20-28℃的周期（10d）波动成功诱导卵巢成熟，排卵次数翻倍。合适的环境因子（如水温、温度和盐度等）与神经内分泌的相互协调是保证虾蟹类每年生殖和蜕皮按一定的时间顺序进行的关键。已有报道，在一些甲壳动物中光周期是生殖的强诱导剂。Kulkami等［55］利用反向高效液相色谱法发现，光照可以引起克氏原螯虾（Procambarus clarkia）中枢神经系统中5-HT含量显著升高；而持续黑暗使其含量降低。在实验室条件下，给美洲龙虾长的光照周期可以显著促进卵巢成熟和Vtg的合成。

6 结语

为进一步了解虾蟹类性腺发育调控的机制，需要综合利用细胞和分子甚至是个体水平的研究手段。本实验室构建了多个拟穴青蟹性腺EST文库，并对性腺和调控性腺发育的主要器官眼柄和肝胰腺进行了转录组测序。发现了多条信号通路在性腺发育中的作用。目前正在利用定量PCR、诱导表达、细胞培养、RNAi等多种技术对已知基因功能进行分析，努力发掘生殖调控相关的未知基因。这将为丰富虾蟹类生殖调控的分子机制提供参考资料。生物的性腺发育是个复杂而有序的生物学过程，随着研究技术手段不断的提高，相信与性腺发育和卵子发生相关的基因将陆续被发现，性腺发育过程中的调控机制也将逐步被人们所认识。

［1］ Nagaraju GPC.Reproductive regulators in decapod crustaceans：an overview［J］.J Exp Biol, 2011, 214（1）：3-16.

［2］ 陈皓文,刘洪展.无脊椎动物高血糖肽激素和速激肽相关肽［J］.海洋科学, 2005, 29（9）：83-87.

［3］ 王在照,相建海.中国对虾3种Ⅱ型CHH家族神经肽基因的克隆及序列分析［J］.遗传学报, 2003, 30（10）：961-966.

［4］ 郭豫杰, 周开亚, 马长艳.中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH1）-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达［J］.中国水产科学,2004, 11（001）：9-13.

［5］ Pervaiz PA, Jhon SM, et al.Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation inmaturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum［J］.World J Zool, 2011, 6（2）：159-163.

［6］ Alikunhi K, Poernomo A, Adisukresno S, et al.Preliminary observations on induction ofmaturity and spawning in Penaeusmonodon Fabricius and Penaeusmerguiensis de Man by eye-stalk extirpation［J］.Bull Shrimp Cult Res Cent, 1975, 1（1）：1-11.

［7］ Arnstein DR, Beard T.Inducedmaturation of the prawn Penaeus orientalis Kishinouye in the laboratory bymeans of eyestalk removal［J］.Aquaculture, 1975, 5（4）：411-412.

［8］ Treerattrakool S, Panyim S, Chan SM, et al.Molecular characterization of gonad-inhibitinghormone of Penaeusmonodon and elucidation of its inhibitory role in vitellogenin expression by RNA interference［J］.FEBS J, 2008, 275（5）：970-980.

［9］ Devaraj H, Saravanakumar M, Thiyagu M.Induction of ovarianmaturation in Penaeusmonodon bymolecular signal interventional approach［J］.J Exp Zool B Mol Dev Evol, 2012, 318（7）：572-585.

［10］ Rotllant G, De Kleijn D, Charmantier-Daures M, et al.Localization of crustaceanhyperglycemichormone（CHH）and gonad-inhibitinghormone（GIH）in the eyestalk of Homarus gammarus larvae by immunocytochemistry and in situhybridization［J］.Cell Tissue Res, 1993, 271（3）：507-512.

［11］ De Kleijn D, Janssen K, Waddy S, et al.Expression of the crustaceanhyperglycaemichormones and the gonad-inhibitinghormone during the reproductive cycle of the female American lobster Homarus americanus［J］.J Endocrinol, 1998, 156（2）：291-298.

［12］ Wongsawang P, Phongdara A, Chanumpai A, et al.Detection of CHH/GIH activity in fractionated extracts from the eyestalk of banana prawn［J］.Songklanakarin J Sci Tech, 2005, 27：789-798.

［13］ Chang ES, Chang SA, Mulder EP.Hormones in the lives of crustaceans：an overview［J］.Am Zool, 2001, 41（5）：1090-1097.

［14］ Nagaraju GPC.Ismethyl farnesoate a crustaceanhormone? ［J］.Aquaculture, 2007, 272（1-4）：39-54.

［15］ Swetha C, Sainath S, Reddy P, et al.Reproductive endocrinology of female crustaceans：perspective and prospective［J］.J Marine Sci Res Development S, 2011, S3：001.

［16］ Tiu SHK, Chan SM.The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonadstimulatinghormone from the shrimp Metapenaeus ensis［J］.FEBS J, 2007, 274（17）：4385-4395.

［17］ Gu PL, Tobe S, Chow B, et al.Characterization of an additionalmolt inhibitinghormone-like neuropeptide from the shrimp Metapenaeus ensis［J］.Peptides, 2002, 23（11）：1875-1883.

［18］ Zmora N, Trant J, Zohar Y, et al.Molt-inhibitinghormone stimulates vitellogenesis at advanced ovarian developmental stages in the female blue crab, Callinectes sapidus 2：novel specific binding sites inhepatopancreas and cAMP as a secondmessenger［J］.Saline Systems, 2009, 5（1）：6.

［19］ Borst D, Wainwright G, Rees H.In vivo regulation of themandibular organ in the edible crab, Cancer pagurus［J］.Proc Biol Sci, 2002,269（1490）：483-490.

［20］ Nagaraju GPC, Prasad GLV, Reddy PS.Isolation and characterization ofmandibular organ inhibitinghormone from the eyestalks of freshwater crab, Oziotelphusa senex senex［J］.Int J Appl Sci Eng,2005, 3（1）：61-68.

［21］ Nagaraju G, Reddy PR, Reddy PS.In vitromethyl farnesoate secretion bymandibular organs isolated from differentmolt and reproductive stages of the crab Oziotelphusa senex senex［J］.Fish Sci,2006, 72（2）：410-414.

［22］ Nagaraju GPC, Suraj N, Reddy PS.Methyl farnesoate stimulates gonad development in Macrobrachiummalcolmsonii（H.Milne Edwards）（Decapoda, Palaemonidae）［J］.Crustaceana, 2003,1171-1178.

［23］ Nagaraju G, Reddy PR, Reddy PS.Mandibular organ ：it’s relation to body weight, sex,molt and reproduction in the crab, Oziotelphusa senex senex Fabricius（1791）［J］.Aquaculture, 2004, 232（1）：603-612.

［24］ Nagaraju G, Borst D.Methyl farnesoate couples environmental changes to testicular development in the crab Carcinusmaenas［J］.J Exp Biol, 2008, 211（17）：2773-2778.

［25］ Zmora N, Trant J, Zohar Y, et al.Molt-inhibitinghormone stimulates vitellogenesis at advanced ovarian developmental stages in the female blue crab, Callinectes sapidus 1：an ovarian stage dependent involvement［J］.Saline Systems, 2009, 5（1）：7.

［26］ Webster S.High-affinity binding of putativemoult-inhibitinghormone（MIH）and crustaceanhyperglycaemichormone（CHH）tomembrane-bound receptors on the Y-organ of the shore crab Carcinusmaenus［J］.Proc Roy Soc Lond B Biol Sci, 1993, 251（1330）：53-59.

［27］ Yano I, Wyban J.Induced ovarianmaturation of Penaeus vannamei by injection of lobster Homarus americanus brain extract［J］.Bull Natl Res Inst Aquaculture, 1992, 21：1-7.

［28］ Subramoniam T.Crustacean ecdysteriods in reproduction and embryogenesis［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2000, 125（2）：135-156.

［29］ Brown MR, Sieglaff DH, Rees HH.Gonadal ecdysteroidogenesis in Arthropoda：occurrence and regulation［J］.Annu Rev Entomol,2009, 54：105-125.

［30］ Lachaise F, Goudeau M, Hetru C, et al.Ecdysteroids and ovarian development in the shore crab, Carcinusmaenas［J］.Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 1981, 362（1）：521-529.

［31］ Okumura T, Sakiyama K.Hemolymph levels of vertebrate-type steroidhormones in female kuruma prawn Marsupenaeus japonicus（Crustacea：Decapoda：Penaeidae）during natural reproductive cycle and induced ovarian development by eyestalk ablation［J］.Fisheries Science, 2004, 70（3）：372-380.

［32］ Tiu SHK, Hui JHL, Mak ASC, et al.Equal contribution ofhepatopancreas and ovary to the production of vitellogenin（PmVg1）transcripts in the tiger shrimp, Penaeusmonodon［J］.Aquaculture,2006, 254（1）：666-674.

［33］ Warrier SR, Tirumalai R,Subramoniam T.Occurrence of vertebrate steroids, estradiol 17β and progesterone in the reproducing females of themud crab Scylla serrata［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2001, 130（2）：283-294.

［34］ Gunamalai V, Kirubagaran R, Subramoniam T.Vertebrate steroids and the control of female reproduction in two decapod crustaceans,Emerita asiatica and Macrobrachium rosenbergii［J］.Current Science, 2006, 90（1）：119-123.

［35］ Lafont R, Dauphin-Villemant C, Warren J, et al.Ecdysteroid chemistry and biochemistry［M］//Gilbert LI, Iatrou K, Gill SS（eds）.Comprehensivemolecular insect science, Pergamon, Amsterdam：Elsevier, 2005：125-195.

［36］ Fairs N, Quinlan P, Goad L.Changes in ovarian unconjugated and conjugated steroid titers during vitellogenesis in Penaeusmonodon［J］.Aquaculture, 1990, 89（1）：83-99.

［37］ Coccia E, De Lisa E, Di Cristo C, et al.Effects of estradiol and progesterone on the reproduction of the freshwater crayfish Cherax albidus［J］.Biol Bull, 2010, 218（1）：36-47.

［38］ Ramachandra Reddy P, Kiranmayi P, Thanuja Kumari K, et al.17α-Hydroxyprogesterone induced ovarian growth and vitellogenesis in the freshwater rice field crab Oziotelphusa senex senex［J］.Aquaculture, 2006, 254（1）：768-775.

［39］ Beltz B.Endocrinology of selected invertebrate types［M］//Laufer H,Downer RGH（eds）Crustacean endocrinology, New York：Alan R Liss, 1988：235-258.

［40］ Tinikul Y, Joffre Mercier A, Soonklang N, et al.Changes in the levels of serotonin and dopamine in the central nervous system and ovary, and their possible roles in the ovarian development in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii［J］.Gen Comp Endocrinol, 2008, 158（3）：250-258.

［41］ Tinikul Y, Mercier AJ,Sobhon P.Distribution of dopamine and octopamine in the central nervous system and ovary during the ovarianmaturation cycle of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii［J］.Tissue Cell, 2009, 41（6）：430-442.

［42］ Sainath S, Reddy PS.Evidence for the involvement of selected biogenic amines（serotonin andmelatonin）in the regulation ofmolting of the edible crab, Oziotelphusa senex senex Fabricius［J］.Aquaculture, 2010, 302（3）：261-264.

［43］ Vaca AA, Alfaro J.Ovarianmaturation and spawning in the white shrimp, Penaeus vannamei, by serotonin injection［J］.Aquaculture, 2000, 182（3-4）：373-385.

［44］ Alfaro J, Zúñiga G, Komen J.Induction of ovarianmaturation and spawning by combined treatment of serotonin and a dopamine antagonist, spiperone in Litopenaeus stylirostris and Litopenaeus vannamei［J］.Aquaculture, 2004, 236（1）：511-522.

［45］ Tinikul Y, Soonthornsumrith B, Phoungpetchara I, et al.Effects of serotonin, dopamine, octopamine, and spiperone on ovarianmaturation and embryonic development in the giant freshwater

prawn, Macrobrachium rosenbergii（De Man, 1879）［J］.Crustaceana, 2009, 82（8）：1007-1022.

［46］ Cahansky AV, Kaiser Dutra B, da Silva Castiglioni D, et al.Induction of ovarian growth in Aegla platensis（Crustacea,Aeglidae）bymeans of neuroregulators incorporated to food［J］.Rev Biol Trop, 2008, 56（3）：1201-1207.

［47］ Rodríguez EM, Medesani DA, Greco LSL, et al.Effects of some steroids and other compounds on ovarian growth of the red swamp crayfish, Procambarus clarkii, during early vitellogenesis［J］.J Exp Zool, 2002, 292（1）：82-87.

［48］ Castiglioni DS, Cahansky AV, Rodríguez E, et al.Induction of ovarian growth in Aegla uruguayana（Anomura, Aeglidae）bymeans of neuroregulators incorporated to food［J］.Rev Biol Trop,2009, 99（3）：286-290.

［49］ Chen Y, Fan H, Hsieh S, et al.Physiological involvement of DA in ovarian development of the freshwater giant prawn, Macrobrachium rosenbergii［J］.Aquaculture, 2003, 228（1-4）：383-395.

［50］ Meeratana P, Withyachumnarnkul B, Damrongphol P, et al.Serotonin induces ovarianmaturation in giant freshwater prawn broodstock, Macrobrachium rosenbergii de Man［J］.Aquaculture,2006, 260（1）：315-325.

［51］ Lovett DL, Tanner CA, Glomski K, et al.The effect of seawater composition and osmolality onhemolymph levels ofmethyl farnesoate in the green crab Carcinusmaenas［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2006, 143（1）：67-77.

［52］ Lovett DL, Verzi MP, Clifford PD, et al.Hemolymph levels ofmethyl farnesoate increase in response to osmotic stress in the green crab, Carcinusmaenas［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2001, 128（2）：299-306.

［53］ Henry RP, Borst DW.Effects of eyestalk ablation on carbonic anhydrase activity in the euryhaline blue crab Callinectes sapidus：neuroendocrine control of enzyme expression［J］.J Exp Zool A Comp Exp Biol, 2006, 305（1）：23-31.

［54］ Aktas M, Kumlu M, Eroldogan O.Off-seasonmaturation and spawning of Penaeus semisulcatus by eyestalk ablation and/or temperature-photoperiod regimes［J］.Aquaculture, 2003, 228（1-4）：361-370.

［55］ Kulkarni GK, Fingerman M.Quantitative analysis by reverse phasehigh performance liquid chromatography of 5-hydroxytryptamine in the central nervous system of the red swamp crayfish, Procambarus clarkii［J］.Biol Bull, 1992, 182（3）：341-347.