田晓 李玲娣 刘金香

病毒介体有昆虫、线虫、螨和真菌等，绝大多数病毒依赖于昆虫传播。传毒昆虫主要集中在同翅目，其中蚜虫传播植物病毒的能力居病毒媒介昆虫的首位，是最主要的传毒介体，而叶蝉和飞虱是仅次于蚜虫的最重要的昆虫介体［1］。介体以非持久性方式（nonpersistent transmission）、半持久性方式（semipersistent transmission）和持久性方式（persistent transmission）传播植物病毒，持久性传播又分为增殖型传播（propagative transmission）和非增殖型传播（nonpropagative transmission）两种［2，3］。在非持久性传播中，介体利用口针连续刺穿植物表皮细胞的细胞膜获毒，故介体获毒时间短暂；在半持久性传播中，介体获毒位点一般在韧皮部，需长时间穿刺，故介体获毒时间在几分钟到数小时之间；而在持久循环型传播和持久增值型传播中，介体获毒时间长达几小时到几天。植物病毒与传播介体的关系，详见表1。最近分子生物学、免疫学和细胞生物学技术的应用，促进了植物病毒介体传播机制的研究。国内外已有对非持久性和持久性传播机制的概述，但对于半持久性传播机制的研究比较少，目前国内尚未见这方面的综述报道。本文就半持久性病毒传播机制研究进展作一概述。

表1 植物病毒与其传播介体的关系

1 半持久性病毒的特性

目前发现的半持久性病毒的种类不多，主要属于长线形病毒科（Closteroviridae）、花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）、曲线病毒科（Flexiviridae）和伴生病毒科（Sequiviridae）等（表2），这些科的病毒粒体形态呈杆菌状、线状或等轴球状，其基因组有单分体和二分体的DNA和RNA。蚜虫以半持久性方式传播花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaic virus，CaMV）、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）和甜菜黄化病毒（beet yellows virus，BYV）等；叶蝉以半持久性方式传播玉米褪绿矮缩病毒（Maize chlorotic dwarf virus，MCDV）、水稻东格鲁球状病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）和水稻东格鲁杆状病毒（Rice tungro badnavirus，RTBV）等；烟粉虱以半持久性方式传播莴苣侵染性黄化病毒（Lettuce infectious yellows crinivirus，LIYV）和长线形病毒属的一些病毒。

2 研究方法

目前研究传播机制的方法主要有免疫印迹和血清学中和试验等，随着各类学科的全面发展，各种技术不断成熟，同时也出现了许多新技术。

2.1 免疫印迹法（immunoblotting）

免疫印迹法是检测蛋白质特性、表达与分布最常用的方法。Tian等［5］应用免疫印迹法分析LIYV病毒粒子，在病毒粒子的抽提液中检测到了外壳蛋 白（capsid protein，CP）、 小 外 壳 蛋 白（minor capsid protein，CPm）、59kD蛋 白（59-kD apparentmolecularmass protein，P59）和热休克HSP70同源蛋 白（heat shock protein70homologue，HSP70h）。Satyanarayana等［6］合成CPm的多克隆抗体并进行免疫印迹分析证实CTV CPm仅由突变体b（在CTV 5'非翻译区第一个茎环结构的顶端）和突变体e（在CTV 5'非翻译区第二个茎环结构的底部）构成。Drucker等［7］将融合表达的P2固定在树脂上，研究CaMV粒子或P3与P2的相互结合发现，只有CaMV和P3同时存在时，病毒与P2才可以相结合，并且CaMV、P3和P2的复合体可以经蚜虫传播。Peremyslov等［8］在提纯病毒 BYV时发现，CP在梯度离心的最上层，且HSP70h、64kD蛋白（64-kD protein，P64）、20kD 蛋白（20-kD protein，P20）和CPm在同一密度梯度最亮，并通过与点突变结合分析发现BYV P20虽是病毒粒子组装必需的蛋白但对其他蛋白与病毒粒子的结合不是必需的。Druka等［9］为了确定从健康植株及感染RTSV植株中萃取的蛋白是否已被纯化，利用免疫印迹法进行分析发现，麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，MBP）抗体与这些蛋白均无交叉反应，这说明纯化的蛋白中已不含MBP。

表2 半持久性病毒的特性

2.2 血清学侵染性中和分析（serological infectivity neutralization analyses）

血清学侵染性中和分析是根据抗体能否影响病毒的侵染性而建立的免疫学试验。Tian等［5］发现，LIYV CPm抗血清几乎完全阻滞了LIYV病毒粒子的传播，推测CPm在LIYV的粉虱传播中有至关重要的作用。Hibino等［10］以薄膜饲喂法为基础利用血清学试验探究与水稻东格鲁病发生相关的病毒。

2.3 免疫金标记和电镜技术（immunogold labeling and transmission electronmicroscopy，IGL-TEM）

结合胶体金探针与病原抗原蛋白达到将病原定位于细胞的目的，并且灵敏度高、操作步骤简便、检测快速。Satyanarayana等［6］通过标记 CTV的CPm抗体发现，CPm包裹病毒5'端RNA。Khelifa等［11］在低密度病毒内含体（electron-lucent viral inclusion bodies，elIBs）中检测到CaMV P2和P3，而在高密度病毒内含体（electron-dense viral inclusion bodies，edIBs）中只检测到CaMV P3，推测edIBs中可能有P3和病毒粒子复合体，elIBs可能有P2、P3及病毒粒子复合体。

2.4 免疫荧光定位（Immunofluorescence technique）

免疫荧光技术特异性强、敏感性高、速度快。Chen等［12］利用免疫荧光定位技术发现，LIYV病毒粒子特异地滞留在烟粉虱的前肠或食窦，且CPm与LIYV病毒粒子的传播密切相关。Martinière等［13］用荧光素标记的二抗免疫确定CaMV 的P2和P3在感病植株的部位发现，P2可以和细胞微管结合，在P2存在的情况下，P3也可以与细胞微管结合，进一步表明病毒与寄主细胞微管的相互作用有助于病毒的介体传播。

2.5 X射线晶体学（X-ray crystallography）

X射线晶体学是将X射线与晶体学联系起来研究各类晶体结构，特别是蛋白质晶体结构。Francois等［14］利用X射线晶体学分析CaMV病毒粒子P3的结构，游离的P3 N端是4个平行的无规则卷曲的四聚体得知未配对P3 N末端是四聚物平行螺旋，并与独特的组织通过二硫键形成反向右手超螺旋。

3 传毒机制

3.1 外壳机制

外壳蛋白参与介体传播有两种方式，一种是只有外壳蛋白决定介体的传播；另一种是介体的传播需要病毒编码的蛋白的参与，外壳蛋白与辅助蛋白共同介导介体传播。只有外壳蛋白决定介体传播的最初证据来自于在没有其他蛋白质或因子的情况下提纯的病毒可以在人工饲喂系统上传播，纯化的LIYV粒体能够由烟粉虱在体外获得后以半持久性方式传播，说明LIYV通过外壳机制传播。LIYV是目前发现的第一个不需要辅助成分就可以通过半持久性方式传播的病毒［15］。

Tian等［5］应用免疫胶体金标记分析LIYV病毒粒子发现，CP覆盖LIYV基因组的95％，CPm仅出现在病毒粒子的一个末端，覆盖基因组的5％。Tian等［5］发现CPm的抗血清能很大程度地降低传毒率甚至无法传毒。为了进一步研究LIYV传播的决定因素，Stewart等［16］构建了LIYV突变体发现，CPm是LIYV烟粉虱传播的必需成分。

3.2 辅助机制

3.2.1 辅助因子 辅助机制研究地比较清楚的半持久性病毒是CaMV。CaMV的蚜传非常复杂，其蚜传需要的3种成分，包括P2、P3和P4。P2 是CaMV编码的18-kD非结构蛋白，被称为辅助蛋白，P2的N端与蚜虫口针结合；P3是CaMV编码的15-kD蛋白，锚定在CaMV病毒粒子上；P4是CaMV主要外壳蛋白［7］。史晓斌等和 Uzest等［17，18］通过绿色荧光蛋白标记发现P2 的滞留位于蚜虫口针末端。体外覆盖试验及活性鉴定表明P3与P2的C端结合，P3连接P4［19，20］，在某种程度上P3在 P2和 P4间起到桥的作用，CaMV通过P2连接到蚜虫口针上。Moreno等［21］发现P2 N端的第六位氨基酸是CaMV蚜传的决定因素。CaMV感染植物时，能诱导形成内含体，内含体中有蚜虫传毒所需的病毒粒子成分——P2、P3及病毒颗粒。此内含体又被称为传播体（transmission body，TB），对蚜虫传毒有重要作用。根据P3的N端特性推断，P3构象变化起到分子开关的作用。P3处于还原态后，能结合内含体的P2或其他成分，若P3处于氧化态，则结合位点被封闭，TB会立刻分解，它的组成成分会分散，从而被蚜虫获得，并推测氧化还原态的改变与蚜虫穿刺植物细胞引起的活性氧相关［14，22］。

MCDV也是通过辅助成分以半持久性方式经叶蝉传播，但对其传播机制的研究很少。Hunt等［23］推测一种类似辅助成分的蛋白存在于MCDV的传播中，但具体成分还未被鉴定。2004年，Rym等［24］分别抽提在健康植株和感染MCDV-S的植株上取食的叶蝉，并利用MCDV-T、R78、R37和R69的抗体与之进行免疫印迹，只有R78与类似P25的25kD蛋白反应。但在感染MCDV-S的植物抽提液中没有检测到25kD蛋白（25-kD protein，P25），只检测到35kD蛋白（35-kD protein，P35）。但带毒叶蝉体内P35的含量没有P25丰富，据此推断P25在叶蝉中不断地累积，而且叶蝉传毒48h后，体内的P25快速消失。推测P25可能是MCDV的辅助成分。

3.2.2 辅助病毒 水稻东格鲁病由分类学上不相关的两种病毒引发，即 RTBV 和 RTSV［25］。Hibino［26］提出水稻同时感染RTBV和RTSV才能表现症状，若只感染RTSV只会表现轻微萎缩。Hibino［27］发现RTBV只有在RTSV存在时才能传播。叶蝉取食感染RTSV或RTBV的植株后传毒，只能在受毒植株中检测到RTSV而不能检测到RTBV。若叶蝉取食感染RTSV的植株再取食感染RTBV的植株后传毒，则健康植株染病；但若叶蝉先感染RTBV再感染RTSV后传毒给健康植株，RTBV仍不能被传播。然这说明RTSV是RTBV的辅助病毒，也为RTBV传播机制的研究提供了有用信息。

峨参黄化病毒（Anthriscus yellows virus，AYV）和欧防风黄点病毒（Parsnip yellow fleck virus，PYFV）均以半持久性方式经蚜虫传播［20］。Murant等［28］在蚜虫前肠中发现PYFV及AYV病毒粒子。蚜虫取食感染PYFV或AYV的植株后，在蚜虫体内只检测到AYV而没有检测到PYFV；蚜虫先取食感染AYV的植株再应用膜饲喂法人为饲喂蚜虫PYFV病毒粒子，则在蚜虫体内同时检测到AYV和PYFV；但若蚜虫先取食健康植株再取食PYFV病毒粒子，则在蚜虫体内检测不到PYFV。这是因为感染了AYV的植物可能存在某种辅助成分，这种辅助成分在PYFV的蚜传中起到关键作用，这表明AYV是PYFV的辅助病毒。

4 展望

侵染植物的病毒的复杂多样使得介体传播机制各异，目前研究较为深入的是辅助机制和外壳机制。病毒的外壳蛋白参与非持久性黄瓜花叶病毒（cucumbermosaic virus，CMV）和持久性双生病毒科（Geminiviridae）等病毒的传播［29-31］，非持久性马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒的介体传播需要辅助蛋白（helper component proteinase，HC-Pro）的参与，马铃薯Y病毒属病毒CP与HC-Pro相互作用［32-34］。除这两种机制外，其他的传播机制尚不清楚。

半持久性病毒的传播特性介于非持久性病毒和持久性病毒之间，对于其传播机制的研究相对较少，只有CaMV和LIYV的传播机制研究较深入。很多半持久性病毒的传播机制并不清楚，如长线形属病毒CTV和BYV。近年来，学者们应用分子生物学及实时荧光定量PCR（Real-time PCR），对蚜虫体内柑桔衰退病毒进行了定性定量测定［35］。虽然对蚜虫传播CTV和BYV的分子特征、传毒特性、传毒率及影响传毒率的因素等方面进行了研究［36，37］，但对橘蚜传播机制的研究一直没有深入进展。Albiach-Martí等［38］通过分析发现，蚜虫会选择性传播CTV分离株的基因组RNA（genomic RNA，gRNA）变异体及缺陷型 RNA（defective RNA，D-RNA）。Herron等［39］发现CTV的P20蛋白（20-kD protein，P20）抗体可以极大地提高褐色桔蚜传播T66IH-3分离株的能力，但大外壳蛋白P25（25-kD protein，P25）、P20蛋白和小外壳蛋白P27（27-kD protein，P27）抗体对褐色桔蚜在体外传播CTV3800和T66aH分离株的能力没有明显影响。Barzegar等［40］分析CTV的非蚜传及蚜传分离株的P27发现，第14、238和239位的氨基酸被带不同电荷和极性的新氨基酸替代，氨基酸的替换可能影响了蚜传效率。He等［41］发现，与BYV 21kD蛋白（21-kD protein，P21）的抗血清相比，BYV 24kD蛋白（24-kD protein，P24）和CP的抗血清抑制了蚜虫对BYV的传播，这表明P24和CP可能参与BYV的蚜传。

荧光标记及血清学试验有助于半持久性病毒传播机制的研究。根据不同的传播机制，制定行之有效的策略来阻断昆虫介体对植物病毒的传播。除此之外，病毒、介体和寄主三者相互作用的深入研究，对于病毒的起源与进化和病毒的流行都具有重要的理论和实际意义。

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