周鹤峰 邵敏 李长福 葛正龙

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii，ES）是一种周生鞭毛、革兰氏阴性无芽胞杆菌，为条件致病菌，新生儿特别是早产儿和免疫力低下的人作为易感染人群，易导致脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎［1］。流行病学调查发现，阪崎肠杆菌主要通过婴儿配方奶粉传播导致感染，死亡率高达50％以上，FAO/WHO已经将其列为A类危险致病微生物［2］。近年来，阪崎肠杆菌感染事件国内外相继报道，已引起世界各国重视，其中较多的是婴儿配方奶粉污染［3］。

目前，阪崎肠杆菌的检测主要依赖传统细菌学分离培养方法、分子生物学等检测手段［4］，我国已于2005年颁布了ES分离与计数检验的行业标准，但上述方法都存在检测周期长、操作繁琐等不足，很难在实际快速检测中得到广泛推广和应用。免疫胶体金层析技术（GICA）具有简单、快速、准确、不需贵重仪器设备和专业技术人员操作等优点，近年来在多个领域得到了较广泛的应用，但将胶体金免疫层析试纸条用于阪崎肠杆菌的检测目前国内外未见报道。本研究利用课题组前期筛选出的杂交瘤细胞株制备了阪崎肠杆菌单克隆抗体，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，双抗夹心法制备胶体金试纸条，并进行初步检测试验，旨在为今后开发商品化的快速检测试纸条产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma公司；柠檬酸三钠、Tween-20购自上海精析化工科技有限公司；硝酸纤维素（NC）膜购自美国Millipore公司；羊抗鼠IgG（二抗）购自上海生工生物工程有限公司；阪崎肠杆菌（ATCC 51392）购自广东环凯微生物科技有限公司；阪崎肠杆菌单克隆抗体为本实验室自制；快速增菌液购自北京陆桥科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 SXCL-3型数显加热磁力搅拌器、超声仪、漩涡混匀仪WH-3 均购自巩义市予华仪器有限责任公司；H-600透射电镜购自日本日立公司；冷冻离心机购自美国Thermo Electron；D U640 紫外光谱扫描仪购自BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 ES单克隆抗体制备及效价检测 培养的阪崎肠杆菌离心收集菌体，加1％的甲醛灭活，计数，PBS稀释至2×108CFU/mL作为免疫原，按0.5mL/只菌液量腹腔免疫BALB/c小鼠，待小鼠血清效价达到要求后，常规方法进行细胞融合、筛选及亚克隆，取培养上清与常见的致病菌进行交叉反应试验检测其特异性。将特异性较强的杂交瘤细胞株通过小鼠体内诱生腹水法制备ES单抗，辛酸-硫酸铵法对单抗进行纯化，单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体的亚型，间接ELISA法检测其亲和力及效价。

1.2.2 胶体金的制备 利用柠檬酸三钠法制备40nm胶体金［5］，具体方法：加热100mL0.01％的氯金酸溶液至沸腾后，迅速用广口试管加入1％的柠檬酸三钠溶液1mL，颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用。利用透射电镜和紫外光谱扫描仪分析胶体金的性状。

1.2.3 标记条件的选择 标记条件包括：最佳标记量以及最佳标记pH值，二者均利用Mey氏稳定性试验确定［6］，具体方法：在酶标板孔中分别加入胶体金 100μL，依次加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5μg的抗阪崎肠杆菌单克隆抗体，混匀10min后各加入10％ NaCl溶液20μL，于10min后肉眼观察反应结果，第一个保持不变颜色孔的抗阪崎肠杆菌单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量增加10％左右为实际标记量；取三支1.5mL离心管各装胶体金1mL，用0.1mol/L HCl和K2CO3分别调pH为7.2、8.2和9.2，加入最佳标记抗体量，对比标记效果。

1.2.4 免疫胶体金制备［7］取10mL胶体金于三角瓶中，用K2CO3调pH为最佳标记条件，加入最佳标记抗体量，搅拌反应30min，得免疫胶体金，8000r/min离心30min，用1mL PBS复溶免疫胶体金备用。将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜上制成胶体金垫。

1.2.5 层析NC膜的制备 将羊抗鼠二抗（C线）和阪崎肠杆菌单克隆抗体（T线）蛋白分别划在NC膜上，二者的浓度分别为0.5mg/mL和1mg/mL，制成层析NC膜。

1.2.6 试纸条的组装及结果判定 胶体金试纸条由样品垫、金标垫、吸收垫、NC 膜和PVC底板组成，按顺序组装试纸条。取50μL样品加于试纸条样品垫上，5min后T线和C线均出现红色条带时为阳性；只有C线显色为阴性；C线不显色，无论T线是否显色，试纸条的检测结果无效。

1.2.7 试纸条性能的评价

1.2.7.1 试纸条灵敏度的检测 将浓度为1×106CFU/mL的ES灭活菌悬液用PBS作倍比稀释，进行敏感性试验，每个稀释度重复两次，并设PBS为阴性对照，以检测到的最低浓度确定为该试纸条的灵敏度。

1.2.7.2 试纸条特异性检测 分别将灭活的16种菌（表2）用PBS稀释至1×106CFU/mL，PBS作为阴性对照，进行交叉反应试验，根据试纸条的检测结果判断其特异性。

1.2.7.3 重复性试验 随机抽取3批自制的试纸条检测3份阳性菌液及阴性对照菌液，每个样品重复检测 10 次，进行批内重复试验和批间重复试验。

1.2.7.4 试纸条稳定性试验 试纸条加上干燥剂并用塑料袋密封后分别于4℃和常温保存，每隔1周取出对相同阳性与阴性样本进行检测，观察其特异性及灵敏度的变化。

2 结果

2.1 单克隆抗体的鉴定

经ELISA筛选共获得了5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1H7、2H9、2B12、4H4和5A5），交叉反应结果显示1H7和2B12的特异性较强。

采用抗体亚类试剂盒测定，1H7和2B12产生的单抗的抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定mAb的相对亲和常数分别为1.23×109L/mol和 2.68×109L/mol，效价分别为 1∶1×107和1∶2×107，表明制备的单抗与阪崎肠杆菌的亲和力较高。

2.2 胶体金质量的鉴定

肉眼观察所制备的胶体金溶液清澈透明，呈深红色，利用紫外光谱扫描仪分析胶体金颗粒，由图1可以看出，胶体金最大吸收波长在538nm，代入回归方程 y=0.786x+505.53（y：Amax；x：粒径大小）［8］，可得胶体金溶液的平均粒径分布在40nm左右。透射电镜图显示胶体金颗粒大小均匀，大部分颗粒呈现圆形，无多角形（图2）。

图1 胶体金紫外扫描图

2.3 标记条件的选择

根据Mey氏稳定性试验，当抗体标记量为2.5μg/100μL（6号）时颜色趋于稳定，所以实际标记量为 2.75μg/100μL（图 3）；在 pH7.2、8.2 和 9.2 三种环境标记的抗体颜色无明显区别，而金标抗体经浓缩在NC膜上与抗原结合后，pH8.2时标记的显色较其他两种明显（图4）。

图2 胶体金颗粒电镜观察结果（20000×）

图3 抗体最佳标记量的确定

图4 最佳pH值的确定

2.4 组装试纸条

根据示意图流程组装试纸条（图5）所示，1为PVC底板，2是将PVC底板的中间的离型纸弃掉，离上边缘17mm处贴上硝酸纤维（NC）膜，3是将吸水纸压住NC膜1mm，4中的红色结合垫喷涂有免疫胶体金，压住NC膜1mm，宽度是7mm，5中的最下面贴有样品垫，压住结合垫2mm，检测时用于过滤和吸收样品，6中的几条胶体金试纸条是5经过切条机切割成的成品胶体金试纸条，整个胶体金试纸条的长度以及各个部分的尺寸可以根据不同的项目调整，以适用不同的层析条件和速度。

图5 试纸条组装流程图

2.5 试纸条性能检测结果

2.5.1 灵敏度检测结果 由表1和图6可看出，5号和6号均为阴性，1号、2号、3号、4号为阳性，其中4号为弱阳性，点样的菌液浓度为1×104CFU/mL，表明该试纸条对阪崎肠杆菌的最低检测浓度为1×104CFU/mL。

表1 试纸条灵敏度试验结果

图6 试纸条的灵敏度

表2 试纸条特异性检测结果

3 讨论

2.5.2 特异性检测结果 应用组装试纸条对浓度为1×106CFU/mL的16种菌进行交叉反应试验，结果均为阴性（表2），表明该试纸条具有较好的特异性。

2.5.3 试纸条重复性试验结果 分别用不同批次试纸条检测，批内与批间结果均无差异，且检测线和质控线条带清晰，表明试纸条的重复性良好。

2.5.4 试纸条稳定性试验结果 制备的试纸条在4℃保存6个月后和常温保存4个月后，与新制备的试纸条对比检测效果无明显差异，特异性与敏感性无变化。

胶体金免疫层析技术因其操作简单，方便快速，灵敏度高，无需专业人员和仪器设备等特点，在生物医学领域显现出越来越广泛的应用前景。

胶体金是指氯金酸在还原剂的作用下还原并聚集形成一定大小的金颗粒，并由于静电作用而形成稳定胶体状态，化学还原法中最常见的还原剂为柠檬酸三钠［9］。金颗粒的粒径大小受还原剂用量的影响，试验中摸索还原剂用量，利用柠檬酸三钠制备胶体金溶液具有可重复性，制备的胶体金颗粒有利于结合抗体，同时有助于自身以及金标抗体的稳定，适用于胶体金的标记，但要制备出质量较好的胶体金溶液，较为干净的器皿也是必不可少的。

标记条件是胶体金免疫层析方法最为关键的一步，其中pH值是免疫胶体金形成的关键［10］，在略高于蛋白质等电点的pH值的条件下，蛋白质能与胶体金表面带有的正电荷牢固结合成免疫胶体金；而抗体蛋白的标记量决定着整个成品的灵敏度，由于胶体金结合抗体蛋白是一定的，如果抗体量少则不能最大可能的逮捕住抗原，导致灵敏度下降；反之抗体多于其饱和标记，一则浪费抗体，二则游离的抗体会跟抗原结合，同样也会导致灵敏度下降。

近年来，各种菌体的胶体金检测试制条相继出现，但灵敏度并不统一。本试验对阪崎肠杆菌的最低检测浓度为1×104CFU/mL，此灵敏度可以满足日常阪崎肠杆菌的筛选工作，而且检测方法简单、时间短，可以定性的判断阪崎肠杆菌的含量范围。

4 结论

本试验通过对pH值和抗体蛋白的标记量等条件进行摸索，得出40nm胶体金最适蛋白标记量为27.5μg/mL，最佳标记pH为8.2，胶体金T线包被多抗浓度为0.5mg/mL，二抗包被浓度为0.625mg/mL。

制备出检测ES胶体金试纸条，借助于简单的增菌过程，在6h内即可检测出样品中是否含有阪崎肠杆菌，检测下限为1×104CFU/mL；与常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、链球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等均无交叉反应，该试纸条为ES的检测提供了一种简单、灵敏、快速的方式。

［1］ Friedemann M.Epidemiology of invasive neonatal Cronobacter（Enterobacter sakazakii）infections［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28（11）：1297-1304.

［2］ 梁鹰, 王红戟.阪崎肠杆菌研究进展［J］.中国微生态学杂志,2008, 20（4）：418-420.

［3］ Joint FAO/WHO Workshop on Enterobacter sakazakii and Other Microorganisms in Powdered Infant Fomula［R］.Geneva：WHO,2004.

［4］ Derzelle S, Dilasser F, Maladen V, et al.Comparison of three chromogenicmedia and evaluation of twomolecular-based identification systems for the detection of Enterobacter sakazakii from environmental samples from infant formulae factories［J］.J Food Prot, 2007, 70（7）：1678-1684.

［5］ Bassab C, Syamal R.Manufacturinghigh-quality gold sol［J］.IVD Technology, 2001, 8：46-54.

［6］ 白丽荣, 毛占伟, 王慧, 等.氨苄青霉素标记的胶体金颗粒的制备及活性研究［J］.生物加工过程, 2008, 6（2）：66-70.

［7］ 姜燕.便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡的研制［J］.生物技术通报, 2011（5）：236-240.

［8］ 贺昕, 熊晓东, 梁敬博, 等.免疫检测用纳米胶体金的制备及粒径控制［J］.稀有金属, 2005, 29（4）：471-474.

［9］ 李志源, 张建斌, 杨百亮.胶体金免疫层析技术在动物疾病诊断中的应用进展［J］.天津农学院学报, 2011, 18（1）：37-41.

［10］ Oliver C, Jamur MC.Immunocytochemicalmethods and protocols［M］.3nd ed.UK：Humano Press, 2010：311-316.