白荷露 刘蕊 朱乃硕

我国是乙肝高发区，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带率为7.18％，慢性乙型肝炎病毒感染者约9 300万例［1］，每年由于HBV引起的肝硬化和肝癌造成263000人死亡［2］。HBV感染与原发性肝癌之间存在着密切关系，但由于缺乏有效的体外病毒感染和复制模型系统，乙肝及相关的原发性肝癌的基础研究和临床研究进展缓慢［3，4］。目前常用的HBV细胞模型HepG2.2.15细胞系，由于其HBV DNA已稳定地整合入肝细胞的基因组并持续表达，这种静态结果无法反映病毒的天然感染过程，在表达量和表达时间上不可调控，使得基因功能的研究产生了很大的局限。建立适合的HBV感染模型对于探索其感染机制，寻找有效的防治方法及开展抗HBV药物的筛选都具有重要的意义［5-7］。因此，我们选用受四环素调控的Tet-On慢病毒系统来实现乙肝病毒X基因（以下简称HBx基因）的可调控表达［8］，并通过施与诱导剂的时间依赖性进行精确转录和翻译，从而模拟HBV天然感染状态以准确获得靶基因的功能分析。

1 材料与方法

1.1 材料

HBx基因来源于质粒H85-T，该质粒为本实验室构建，含有C基因型，adr亚型的HBV病毒1.2倍基因组序列。菌株E.coli DH5α购自百泰克，人肝癌细胞株HepG2购自ATCC细胞库。四环素诱导型慢病毒表达系统（Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System，包括调控质粒pLVXTet-On-Advanced和表达质粒pLVX-Tight-Puro），病毒滴度测定试剂盒（Lentil-XTMp24 Rapid Titer Kit）购自Clontech公司。PrimerStar高保真聚合酶，EcoR I、Not I限制性内切酶，T4连接酶，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶和dNTPs购自申能博彩公司。质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司。强力霉素，嘌呤霉素，Polybrene购自Sigma公司，G418购自Gibco公司。……