白荷露 刘蕊 朱乃硕

我国是乙肝高发区，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带率为7.18％，慢性乙型肝炎病毒感染者约9 300万例［1］，每年由于HBV引起的肝硬化和肝癌造成263000人死亡［2］。HBV感染与原发性肝癌之间存在着密切关系，但由于缺乏有效的体外病毒感染和复制模型系统，乙肝及相关的原发性肝癌的基础研究和临床研究进展缓慢［3，4］。目前常用的HBV细胞模型HepG2.2.15细胞系，由于其HBV DNA已稳定地整合入肝细胞的基因组并持续表达，这种静态结果无法反映病毒的天然感染过程，在表达量和表达时间上不可调控，使得基因功能的研究产生了很大的局限。建立适合的HBV感染模型对于探索其感染机制，寻找有效的防治方法及开展抗HBV药物的筛选都具有重要的意义［5-7］。因此，我们选用受四环素调控的Tet-On慢病毒系统来实现乙肝病毒X基因（以下简称HBx基因）的可调控表达［8］，并通过施与诱导剂的时间依赖性进行精确转录和翻译，从而模拟HBV天然感染状态以准确获得靶基因的功能分析。

1 材料与方法

1.1 材料

HBx基因来源于质粒H85-T，该质粒为本实验室构建，含有C基因型，adr亚型的HBV病毒1.2倍基因组序列。菌株E.coli DH5α购自百泰克，人肝癌细胞株HepG2购自ATCC细胞库。四环素诱导型慢病毒表达系统（Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System，包括调控质粒pLVXTet-On-Advanced和表达质粒pLVX-Tight-Puro），病毒滴度测定试剂盒（Lentil-XTMp24 Rapid Titer Kit）购自Clontech公司。PrimerStar高保真聚合酶，EcoR I、Not I限制性内切酶，T4连接酶，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶和dNTPs购自申能博彩公司。质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司。强力霉素，嘌呤霉素，Polybrene购自Sigma公司，G418购自Gibco公司。鼠抗HBxAg单抗购自Abcam公司，HRP标记的羊抗鼠IgG多抗、FITC标记的羊抗鼠IgG多抗、鼠抗GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物公司。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增HBx基因片段 HBx基因序列共465bp。根据实验室已构建的含有C基因型，adr亚型的HBV1.2倍基因组序列的H85-T质粒，设计X基因引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。乙肝病毒X基因扩增引物选用Not I和EcoR I酶切位点，引物序列为XF：5'-ATTTGCGGCCGCATGGCTGCTAGGGTGT3'，XR：5'-CCGGAATTCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3'。

应用PrimerStar高保真聚合酶扩增HBx基因，PCR 反应条件为 ：98℃ 3min；98℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min。采用切胶回收试剂盒回收PCR扩增条带。

1.2.2 HBx基因慢病毒表达载体的构建 将HBx基因扩增回收产物和pLVX-Tight-Puro载体分别用限制性内切酶Not I和EcoR I双酶切后纯化回收，T4连接酶连接过夜，转化E.coli DH5α感受态，氨苄青霉素筛选培养，挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行PCR，双酶切和DNA测序验证。

1.2.3 慢病毒的制备和滴度测定 在100mm的细胞培养皿中接种4×106-5×106HEK293T细胞，培养过夜使细胞密度达到80％左右，将3μg构建的表达载体质粒与15μL的慢病毒包装质粒混合物混合后，应用试剂盒中的磷酸钙转染试剂转染到HEK 293T包装细胞系中，8h后更换新鲜培养基，48h后收集培养上清，获得包装好的病毒颗粒，离心后分装冻存。

采用病毒滴度测定试剂盒测定病毒P24含量（P24为HIV核心蛋白，其氨基酸序列高度保守，常用于病毒检测），计算病毒的滴度。将收集的病毒上清液稀释100倍后，与梯度稀释的标准品一起加入包被有P24捕获抗体的96微孔板中，依次加入生物素标记的P24抗体，HRP标记的链霉亲和素，最终加入显色液显色。测定450nm吸光值（Spectrum M5微孔板检测系统，Molecular Device公司），根据标准曲线换算P24的量（单位为pg/mL），计算病毒的滴度。换算公式为1ng≈1.25×107LPs（LP表示病毒颗粒数量）。

1.2.4 稳定转染的HBx基因的HepG2细胞系的构建和鉴定 将HepG2细胞以2×105的密度接种于6孔板中，含有四环素调控元件rt-TA的病毒感染细胞，1200 g离心90min可提高感染效率。感染8h后换液用G418（600μg/mL）筛选，7-8d筛选稳定后扩大培养，再用含有HBx基因的病毒感染，8h后换液用Puromycin（0.5μg/mL）筛选，3-4d筛选稳定后扩大培养，获得稳定细胞株HepG2-HBx（reg）。

提取HepG2-HBx（reg）细胞基因组DNA，以根据载体序列设计的引物进行PCR扩增鉴定，四环素调控元件rt-TA序列验证引物：upper 5'-ACAAGGAAACTCGCTCAAA-3'，down 5'-GGCATAGAATCGGTGGTAG-3'。乙肝病毒X基因重组慢病毒质粒的序列验证引物：upper 5'-TAGTGAACCGTCAGATCG-3'，down 5'-CAGACTGCCTTGGGAAAA-3'。反应条件：94℃ 3min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35 个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 反向PCR鉴定HBx基因及调控基因的整合 我们选用EcoR I酶对细胞基因组进行酶解，pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced质粒均含有EcoR I的酶切位点，分别在靠近慢病毒质粒的5' LTR区和靠近EcoR I区分别设计两对上下游引物。pLVX-Tight-Puro-HBx第一对引物：pEH125：5'-TGTACTAGGAGGCTGTAGG-3'；pEH119：5'-GATCTTTGTACTAGGAGGCT-3'。pLVX-Tet-On-Advanced第一对引物：ToE112：5'-ATGCCCTTGACGACTTTG-3'；ToE41：5'-ACAGCTAAAGTGCGAAAG-3'。pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced第二对 引 物 ：pEH232：5'-TTGTCTTCTTTGGGAGTG-3'；pEH287：5'-TCTGCTAATCAGGGAAGTA-3'。

选用EcoR I酶对细胞基因组总DNA充分酶解，50μL酶切体系中含有1μg基因组和5 U限制性内切酶，37℃酶切5h。酶切片段纯化后，溶于30μL 无菌水中。将 30μL 溶解产品于 400μL 自连接体系中16℃连接过夜。连接产品经纯化后溶于30μL无菌水中。半巢式PCR一扩的PCR引物分别为pEH125/pEH119，ToE112/ToE41，PCR二扩的引物为pEH232/pEH287。PCR反应条件为：94℃ 5min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 60s，35 个循环 ；72℃延伸10min。PCR产物经凝胶回收后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，筛选重组质粒后测序克隆片段。

1.2.6 HBx基因可诱导表达的鉴定 将筛选稳定的HepG2-HBx（reg）细胞均分为两份，一份加Dox（1.0mg/mL）诱导培养，一份不加Dox（0mg/mL）培养，48h后收集细胞。

1.2.6.1 RT-PCR鉴定RNA的表达 提取细胞总RNA，DNase I处理后，逆转录为cDNA，以HBx基因的特异性引物进行PCR鉴定，引物为最初基因扩增的引物，程序同DNA鉴定。β-actin内参引物序列：F1379：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'；R1663：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.2.6.2 Western blot鉴定HBx蛋白的表达 利用RIPA蛋白抽提液提取细胞内总蛋白，经过SDSPAGE电泳后，恒流300mA 1h电转移到硝酸纤维素膜上，转膜封闭后，依次加入鼠抗HBxAg单抗，HRP标记抗IgG多抗孵育，NBT/BCIP 底物显色，观察蛋白的表达情况。

1.2.7 细胞免疫荧光试验 将筛选稳定的HepG2-HBx（reg）细胞以105接种于12孔板，置于细胞培养箱中培养过夜。细胞分为4组，每组3个重复孔，分组情况如下：

自发荧光对照组：不加一抗和二抗（都用含1％BSA的PBS代替）；空白对照组：不加一抗（用含1％ BSA的PBS代替），直接加二抗；未诱导试验组：未加Dox（0mg/mL），加一抗，加二抗；诱导试验组：加Dox（1.0mg/mL），加一抗，加二抗。

待细胞已基本铺满盖玻片时，用不完全培养基继续培养12h后进行细胞免疫荧光试验，以排除小牛血清中蛋白对试验的影响。

将细胞用预冷的丙酮室温固定于细胞板中，封闭2h后，在细胞孔内滴入鼠抗HBxAg单抗，4℃湿盒内孵育过夜，随后加入FITC标记的羊抗鼠IgG多抗室温孵育30min，洗净后于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。

2 结果

2.1 PCR扩增HBx基因片段

HBx基因大小为465bp，PCR扩增HBx基因产物经琼脂糖凝胶电泳后结果（图1）显示，其基因片段大小与预期的相符，表明已成功获取HBx基因片段。

图1 PCR扩增X基因片段

重组质粒pLVX-Tight-Puro-HBx经PCR扩增验证，扩增的条带大小相符；经限制性内切酶Not I和EcoR I双酶切验证，酶切条带与目的基因大小相符（图 2）。

图2 pLVX-X基因重组质粒PCR及酶切

2.2 慢病毒的制备和滴度测定

细胞转染后48h收集上清获得重组病毒颗粒，经病毒滴度试剂盒检测，包装出的病毒滴度约在108LPs/mL左右。

2.3 稳定转染的细胞系HepG2-HBx（reg）的构建与鉴定

含有四环素调控元件rt-TA和HBx基因的重组病毒颗粒先后感染细胞，分别用600μg/mL浓度的G418和1.0μg/mL浓度的Puromycin筛选细胞，获得稳定细胞株HepG2-HBx（reg）。PCR扩增鉴定结果如图3所示，证明了HepG2-HBx（reg）细胞中同时含有四环素调控元件和乙肝病毒X基因。

图3 HepG2-HBx（reg）细胞PCR鉴定

2.4 反向PCR鉴定HBx基因的整合

应用反向PCR对于慢病毒载体介导基因的整合进行了验证，二轮PCR鉴定结果如图4及图5所示。对上述挑取的克隆进行测序分析，通过对插入位点旁侧序列的比对分析，其序列确是人类基因组中序列，分布于不同染色体中。pLVX-Tight-Puro-HBx反向转化子共挑取10个克隆进行测序，测序结果经NCBI数据库比对，发现了7个插入位点（表1）；pLVX-Tet-On-Advanced反向转化子共挑取8个克隆进行测序，经比对，发现了4个插入位点（表2）。证明慢病毒感染HepG2细胞后目的基因的确整合于细胞基因组中。

2.5 HepG2-HBx（reg）细胞中X基因可诱导表达的鉴定

RT-PCR结果（图4）显示，加入Dox诱导的细胞中检测到X基因的RNA表达，而没有加入Dox（0mg/mL）的细胞中则检测不到X基因的RNA表达。Western blot试验结果显示同上，加入Dox（1.0mg/mL）诱导的细胞中检测到X基因的蛋白表达，而未加入Dox的细胞中则检测不到X基因的蛋白表达（图5），HBV X蛋白大小约为17kD，内参β-actin蛋白检测条带大小约为42kD，试验结果与理论值基本相符，说明可诱导表达细胞试验模型构建成功。

表1 pLVX-Tight-Puro-HBx反向转化子整合位点旁侧序列分析

表2 pLVX-Tet-On-Advanced反向转化子整合位点旁侧序列分析

图4 HepG2-HBx（reg）细胞RT-PCR诱导表达验证

2.6 HepG2-HBx（reg）细胞免疫荧光试验

在放大400倍（目镜10×物镜40）的荧光显微镜下观察，细胞免疫荧光试验结果（图6）显示，

图5 HepG2-HBx（reg）细胞Western blot诱导表达验证

3 讨论

针对病毒性肝炎的研究，抗病毒药物的开发和评价中的重要环节之一就是建立一种方便有效，且与人类天然感染近似的试验模型。随着现代科学技术的发展，有关HBV的细胞和动物模型相继建立。现有HBV体外感染的细胞模型主要包括人原代肝细胞（primaryhumanhepatocytes，PHH）、HepRG细胞和HepG2.2.15细胞等［9-11］，但其均有各自的缺陷。PHH细胞的分离和体外培养较困难；HepRG细胞培养需DMSO化学诱导，可能对HBV感染和表达过程有所影响［11，12］；HepG2.2.15细胞是目前应用较为广泛的细胞模型，但由于其HBV DNA已稳定地整合入肝细胞的基因组，无法模拟HBV天然的感染过程［6］。目前，在实验室中构建的多数HBx研究模型，是在外源强启动子（如CMV启动子）控制下稳定的表达，以非整合病毒来源的载体为工具研究其在诱发肝炎和肝癌形成中的作用，而这并不理想［13］。

慢病毒具有可以有效地整合入宿主细胞并稳加入Dox（1.0mg/mL）诱导的细胞于荧光显微镜下观察到绿色荧光，而没有加入Dox（0mg/mL）的细胞中则没有观测到绿色荧光。再次证明可诱导表达细胞试验模型的构建成功。

图6 HepG2-HBx（reg）细胞免疫荧光试验

上述多种试验方法的结果说明了HBx基因在细胞中实现了蛋白表达的可调控性，将为开展乙肝病毒持续感染和致病的研究，以及抗HBV药物的筛选提供较为理想的试验模型。定表达外源基因的优势，并不易诱发免疫反应，适用于体内基因治疗，是一种较为理想的基因转移载体［14］。本试验利用已广泛运用的Tet-On调控系统，应用慢病毒感染的途径成功构建了乙肝病毒X基因的可调控表达细胞模型，应用多种方法鉴定了HBx基因的诱导表达，实现蛋白表达的可调控性。

实验室同时构建了HBV其他基因的可调控细胞模型，拟在细胞模型的基础上，通过人为控制蛋白的表达来观察HBV蛋白表达前后细胞内的整体变化趋势，更全面系统地研究HBV对宿主的影响。随后，我们拟通过芯片和蛋白质组学等方法分析这些病毒组分感染宿主的过程中对宿主的MicroRNA及蛋白质组的影响，特别是一些机体免疫和肿瘤发生相关分子的变化，进一步对其在宿主内改变表观遗传修饰及形成免疫耐受的作用机理进行深入研究。

4 结论

本研究应用四环素Tet-On调控系统构建了乙肝病毒X基因的诱导表达载体，经HEK 293T细胞包装获得含有调控元件rt-TA和HBx基因的病毒颗粒，P24法测定滴度达到108LPs/mL。将两种病毒先后感染HepG2细胞系，经G418和Puromycin抗生素筛选获得整合有HBx基因的稳定细胞株HepG2-HBx（reg），并应用RT-PCR和Western blot等方法验证了HBx基因的可诱导表达。该细胞模型的成功构建为研究HBx基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了一种较理想的试验模型。

致谢：本实验室博士研究生汤必奎和硕士研究生孙勇曾对本课题的研究和部分试验内容给予帮助，在此由衷的表示感谢。

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