黄杏 杨丽涛 张保青 宋修鹏 李杨瑞 王盛

甘蔗（Saccharum officenarum L.）作为我国最主要的糖料作物，起源于热带及亚热带地区，属喜温作物。近年来，频发的寒害冻害对甘蔗的生产造成了巨大的损失［1-3］。脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物对逆境胁迫的防卫机制成员之一［4，5］。在逆境条件下，它与ABA结合蛋白的结合能力增强，并感知和传递环境信号，以启动植物体内的应激反应，提高植物抗御各种逆境因子的胁迫能力［6-8］。在低温胁迫过程中，内源ABA含量显著增加，表明ABA参与植物低温胁迫信号转导［9，10］。目前已发现有150多种基因可受ABA的诱导，其中包括在植物器官中受环境胁迫诱导表达的基因［11］。脱落酸胁迫成熟诱导蛋白（ABA-/stress-/ripening-induced protein，ASR）是一类亲水性极强的小分子热稳定蛋白，其表达调控受脱落酸、胁迫及成熟的诱导［12］。前人关于ASR的研究主要集中在果实成熟和衰老方面［13，14］，随着对ASR研究的不断深入，发现它与干旱、盐胁迫及低温等非生物胁迫之间也存在着一定的应答关系［15-17］，但目前对此基因的研究还仅限于百合［18］、葡萄、香蕉等少数植物，且从分子角度研究甘蔗的ASR与环境胁迫间的关系鲜有报道。本课题组在前期甘蔗抗寒抗旱的蛋白质组学研究中也发现，渗透和低温胁迫下甘蔗体内ASR蛋白的表达量发生了显著的变化［19］。在此基础上，本研究运用同源克隆和RT-PCR技术克隆了甘蔗脱落酸胁迫成熟诱导蛋白（ASR）基因；构建了其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达；同时利用荧光定量PCR技术分析了ASR基因在低温胁迫和ABA处理下的表达模式，为进一步探索ASR基因在逆境胁迫中的生子生物学功能和甘蔗抗寒分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2011年3 月至2011年12 月在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室完成。以抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号（GT28）和抗寒性弱的甘蔗品种园林6号（YL6）作为研究材料。将两个甘蔗品种的单芽种茎进行脱毒处理后放进沙盘中进行沙培。待甘蔗长出2-3叶时，将蔗苗从沙中移出，选取长势一致的甘蔗苗移栽至20cm×25cm（直径×高）的营养盆中，每盆装混合土4kg（土∶有机肥∶沙=6∶3∶1，W/W），每盆种植2株，并把营养盆移至智能温室大棚，按日常管理生长40d，然后转入人工气候室（温度为28℃，光强为250-300μmol/m2·s，12h 光 周 期， 相 对 湿 度 60％-70％）培养10d，甘蔗长到5-6叶期时，分组进行处理。第一组处理为低温+喷施ABA（100μmol/L ABA），记为LA；第二组处理为低温+喷施清水，记为L（注：喷施程度以叶面喷施欲滴为度，于甘蔗苗进行低温处理前12h喷施）。低温处理下，温度为0℃，光强为 250-300μmol/m2·s，12h光周期，相对湿度60％-70％。分别在处理0、1、7和14d剪取甘蔗+1叶，用液氮速冷后存于-80℃冰箱备用。

大肠杆菌DH5α、凝胶回收试剂盒购自Bioer公司；Dream Taq酶、pMD18-T载体试剂盒、IPTG、X-gal、IPTG、dNTPs均购自TaKaRa宝生物工程有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自上海生工，引物合成及测序由上海生工完成。pET-30a（+）载体和大肠杆菌BL21（DE3）由本实验室保存。DNA Ligation连接试剂盒、EcoRⅠ、Hind Ⅲ 购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 甘蔗叶片总RNA提取按北京康为世纪生物科技有限公司Trizol说明书进行，cDNA合成用TaKaRa宝生物工程有限公司M-MLV逆转录酶，逆转录引物为Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具体步骤按说明书进行，完成后取4μL PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检查并用紫外分光光度计检测cDNA 浓度，最后将各处理cDNA浓度稀释至同一浓度。

1.2.2 SoASR 基因的克隆与生物信息学分析 以NCBI中已报道的玉米、水稻等物种的ASR 基因为参照，运用NCBI BLAST搜索其对应的核酸序列，选取同源性较高的核酸序列进行比对分析并利用DNAMAN软件设计该基因上游简并引物ASR：5'-ATG（T/G）C（T/C/G）（C/G）A（G/A）GAG（C/A）A（G/T）CA（C/T）CACCA-3'，下游引物为逆转录加尾引物 3 side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。获得该基因全长后在其编码框首尾设计引物F：5'-ATGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'和 R：5'-TCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTCTTC-3'进行扩增以验证序列准确性。扩增ASR 基因的PCR体系为25μL，模板为不同处理cDNA 等量的混合样，具体操作按照Dream Taq酶说明书进行。PCR扩增参数为：95℃预变性 5min ；95℃ 40s，58℃ 50s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸8min。所有PCR产物经1.5 ％ 的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带后连接pMD18-T载体（TaKaRa）后转化DH5α（Trans Gen）感受态细胞，筛选阳性克隆，送上海生工测序。

用BioXM 2.6预测基因氨基酸序列；利用NCBI在线分析软件检索各基因与其他物种的同源性；用MEGA 4.0软件构建每个基因与其他物种氨基酸序列的进化树；在线软件（http：//isoelectric.ovh.org/）分析基因氨基酸序列的蛋白质分子量和等电点大小；用WoLF PSORT在线软件分析基因亚细胞定位；用SOSUI signal软件预测基因信号肽；用ExPASy Proteomics Server在线软件预测基因的亲水性和跨膜结构；用SOPMA软件预测基因的二级结构；用Motif Scan在线软件分析基因蛋白质功能结构域。

1.2.3 SoASR基因的原核表达 以pET-30a（+）为表达载体，根据SoASR基因ORF，设计SoASR表达载体构建引物SoASR pET-30aF：5'-CGGAATTCA TGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'，SoASR pET-30aR：5'-CCAAGCTTTCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTC TTC -3'（下划线部分分别为N端EcoRⅠ酶切位点和C端Hind Ⅲ酶切位点），进行PCR扩增后回收纯化后和pET-30a载体分别用EcoRⅠ+Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切产物，用DNA Ligation 连接试剂盒连接目的基因与载体，获得重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），Kan抗性筛选，进行测序和双酶切鉴定。

将重组菌株在LB 液体培养基中37℃培养至OD600约0.4-0.6，以空载体 pET-30a（+）（BL21）为对照，加入IPTG至终浓度到1mmol/L和2mmol/L，37℃下分别诱导0、2、4和6h，收集菌液各2mL。将所收集菌液于5000r/min离心5min，弃去上清，在向沉淀中加入200μL 3×上样缓冲液，沸水浴5min，冰上冷却后，取20μL进行SDS-PAGE 电泳分析（SDS-PAGE 的浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12.5％）。电泳结束后用0.5％考马斯亮蓝R-250进行染色，成像分析。

1.2.4 SoASR基因的实时荧光定量表达分析 根据获得的SoASR 基因全长序列设计荧光定量PCR特异性引物SoASR QF：5'-GAGTACACGGAGACCACGGT-3'、SoASR QR ：5'-TCTCGTAGAGTGCGAAGGC-3'，以甘蔗25S rRNA基因（BQ536525）为内参，设计内参引物25S rRNA QF：5'-GTCAGAAAAGTTACCACAGGGA-3'、25S rRNA QR：5'-GGTAAAACTAACCTGTCTCACGA-3'。荧光定量PCR反应在ABI Stepone Plus型荧光定量PCR仪上进行，反应体系为20μL，方法参照天根公司荧光定量试剂盒Real Master Mix（SYBR Green Ⅰ）说明书。反应参数：95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 20s，40个循环。按照2-ΔΔCT法计算出基因表达水平的相对表达量。

2 结果

2.1 总RNA提取及检测

取4μL甘蔗叶片总RNA经1.0％凝胶琼脂糖凝胶电泳检测。图1结果表明RNA带型完整清晰，18S和28S两条带比较完整且较亮，5S则隐约可见，并无杂质污染，说明所提取的甘蔗RNA质量较好。紫外分光光度计测定，RNA的OD260/OD280值在1.85-1.95之间，OD260/OD230值在2.0-2.2之间，说明提取的总RNA 完整度和纯度都较高，可进行后续试验。

图1 甘蔗叶片总RNA琼脂糖检测

2.2 SoASR 基因全长cDNA克隆

以混合甘蔗叶片cDNA为模板，用简并引物ASR引物和3 side通用引物进行PCR扩增，扩增得到一条750bp左右的片段（图2），经过回收、克隆和测序后在NCBI进行比对，结果为甘蔗ASR基因cDNA全长。其cDNA全长序列为753bp，包含启始密码子ATG和终止密码子TAA，命名为SoASR，GenBank登录号为JX470187。该基因cDNA序列包含一个429bp的ORF，编码142个氨基酸，另外包含324bp的3'非编码区，3'非编码区还包括一个18bp ploy（A）尾巴。

2.3 SoASR基因生物信息学分析

图2 甘蔗SoASR基因PCR扩增结果

生物信息学分析显示，SoASR蛋白分子量大小为25.9kD，等电点为6.1。Glu、Ala的出现频率较高，分别为19.0％和14.1％；Met、Arg频率较低，为0.07％。亚细胞定位显示其主要位于细胞核。该基因氨基酸序列不含信号肽，是一类可溶性蛋白，没有跨膜区域；疏水性最小值为-5.7，最大值为4.5；该基因氨基酸序列未发现糖基化位点，含有1个Ser、2个Thr和3个Tyr磷酸化位点。该基因二级结构预测显示：含有81个α-螺旋，占57.04％；随机卷曲31个，占21.83％；延伸链15个，占10.56％；β-转角15个，占10.56％。该基因氨基酸序列功能结构域分析表明，40-43、46-49两个为酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，72-77、2-32两个为N-肉豆蔻酰化位点，6-13为富含组氨酸结构域，53-132为脱落酸/WDS诱导蛋白结构域（图3）。

图3 SoASR基因编码区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列

用MEGA 4.0软件构建了甘蔗SoASR基因与其它12个物种氨基酸序列的进化树。结果（图4）表明，13个不同物种ASR基因被聚为4个组，草莓和盐角草为一组，水稻单独为一组，银杏和云杉为一组，其余为一组，而甘蔗SoASR与大蕉、玉米和高粱聚为一小组，同源性为79％、93％和88％，说明甘蔗和玉米、高粱等的亲缘关系较近。

图4 甘蔗SoASR基因与其它物种ASR基因的氨基酸序列同源性分析

2.4 SoASR基因原核表达载体构建及诱导表达

大量提取pMD18T-SoASR和pET-30a（+）质粒并进行纯化，利用EcoRⅠ+Hind Ⅲ分别进行双酶切，回收插入目的片段和表达载体，按DNA Ligation连接试剂盒说明进行连接，获得重组质粒pET30a-SoASR。以重组表达质粒pET30a-SoASR 为模板，PCR扩增出429bp 左右的片段，并将重组质粒阳性克隆测序，结果（图5- A）表明插入片段与克隆序列完全一致，ORF 正确。在此基础上，又用EcoRⅠ+Hind Ⅲ双酶切重组质粒pET30a-SoASR，可切得约5 460bp的pET-30a（+）载体片段和429bp 左右SoASR基因片段（图5- B），表明SoASR 基因已插入载体质粒中，SoASR基因的原核表达载体pMD18TSoASR构建成功。

将鉴定后的pET30a-SoASR和空载体pET-30a（+）转入表达菌BL21（DE3）中，用1mmol/L和2mmol/L的IPTG进行诱导表达，表达产物SDS-PAGE电泳结果如图6。在2 个不同浓度和不同时间的IPTG 诱导下，均能诱导出融合蛋白，而对照则没有融合蛋白表达。在分子量约为32.0kD的位置上存在1 条融合蛋白诱导表达的条带，与SoASR编码蛋白分子量理论值基本相符，表明原核表达载体构建正确。

图5 重组质粒pET30a-SoASR PCR和双酶切验证结果

图6 SoASR在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图谱

2.5 SoASR基因在低温胁迫和ABA处理下的表达分析

由图7可知，低温胁迫下，SoASR基因在未喷ABA处理的两个甘蔗品种中表达趋势不同，在GT28L中其表达趋势为先升后降，在胁迫1d时达到最大，分别为胁迫0、7和14d的7.4倍、4.6倍和11.2倍；在YL6L中其表达呈下降趋势，并在胁迫14d时降到最低，为0d的13.5％。加ABA处理的两个甘蔗品种SoASR基因的表达都呈下降趋势，在胁迫14d时降到最低，分别为未进行低温处理前的13.5％和2.8％，相比之下，YL6LA的降幅要大于GT28。外喷ABA后，SoASR基因的表达明显被诱导，在胁迫0d时，GT28LA为GT28L的9.6倍，YL6LA为YL6L的2.9倍。

图7 两个甘蔗品种SoASR基因在低温胁迫和ABA处理下的表达

3 讨论

脱落酸（ABA）作为一种重要的植物应答逆境胁迫的调节因子，在植物抵御如低温等不良胁迫反应中起着重要的作用。虽然目前大量研究证实ABA途径及ABA诱导合成的关键基因受各类胁迫的影响，但ABA响应低温胁迫的应答机制还不清楚。克隆甘蔗ASR蛋白，可为进一步研究ABA在甘蔗抗逆胁迫中的作用提供理论基础。本研究发现，甘蔗SoASR基因虽与玉米、水稻的同源性较高但与其它物种的同源性较低，说明ASR基因在进化过程中变异较大。同时，SoASR基因氨基酸序列不含信号肽，也未有跨膜区域和糖基化位点；亚细胞定位确定其位于细胞核。有研究表明植物大约1/3 ASR定位于细胞核，其它大多数分散在细胞质中；而ASR作用主要在细胞核中，并通过核定位信号参与多个核质运输途径［12］。但现有研究证明，ABA参与逆境胁迫时作为信号分子功能通过ABA受体将其运到效应部位，进而诱导植物提高抗逆性［12，20］，因此，推测ASR基因是通过其氨基酸序列中的磷酸化位点，即酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点进行蛋白磷酸化来介导ABA信号转导的，使蛋白激酶总活性增加来减少活性氧的生成，起到抗氧化防护作用［21］。通过对SoASR基因在低温胁迫和ABA处理下表达的研究，发现低温胁迫下SoASR基因在抗寒性强品种GT28中上调表达，并在胁迫1d迅速达到峰值，而在抗寒性弱的品种YL6中却一直表现为下调表达。推测SoASR基因可能在甘蔗抗寒过程中发挥了信号传导作用，进而能将更多的信号传送出去，通过蛋白质磷酸化参与ABA诱导下游基因表达，从而起到保护作用［22，23］；而在YL6中表达的下调，也就阻碍了其信号转导和下游基因的表达调控，从而表现出低抗寒力。外喷ABA处理后，SoASR基因在两个甘蔗品种中的表达都明显上调，这样可加强ASR基因通过磷酸化和去磷酸化来介导ABA信号传导途径，提高甘蔗自身抗氧化防护的能力。这在草莓上也有相似的报道［24］。由此可见，SoASR基因与甘蔗的抗寒性密切相关，下一步将通过抗体制备和转基因等方面的研究，进一步探讨SoASR基因在甘蔗低温胁迫中的作用机制。

4 结论

采用同源克隆和RT-PCR技术克隆了甘蔗SoASR 基因全长429bp的完整编码序列，GenBank登录号为JX470187，编码142个氨基酸的蛋白。原核表达结果表明该基因以融合蛋白形式表达，相对分子量约为32.0kD。结果表明，低温胁迫下该基因在抗寒性不同的品种中表达特性不同，但在抗寒性不同的品种中该基因的表达都受ABA的诱导，推测SoASR 基因在甘蔗抗寒机制中发挥某种作用。

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